甲醛固定的H22细胞联合IL-2抑制小鼠H22肝癌生长效果观察

目的 观察甲醛固定的H22肿瘤细胞联合IL-2对小鼠H22肝癌细胞腹部移植瘤生长的影响.方法 20只小鼠,均采用股部皮下1×105个H22细胞的方法建立小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型.将其随机分为A、B、C、D组,各5只.肿瘤直径超过1 cm后A、B、C、D组分别瘤内注射生理盐水、甲醛固定H22细胞、IL-2、甲醛固定H22细胞+IL-2各0.5 mL.H22细胞浓度为106/mL,IL-2浓度为8×103 IU/mL.每3d注射1次,共注射4次.治疗结束处死动物,取瘤称重,并计算抑瘤率.采用免疫组化SABC法对肿瘤组织染色,光景下观察瘤内CD8+T淋巴细胞表达情况.结果 A、B、C、D组肿瘤治疗后质量分别为(6.683 ±1.102)g、(2.851 ±0.223)g、(2.282 ±0.443)g、(1.052±0.225)g,B、C、D组与A组相比明显降低,D组与B、C组相比明显降低(P均＜0.05).B、C、D组抑瘤率分别为51.58％、60.54％、80.96％.D组小鼠瘤体内大量肿瘤细胞变性和坏死,且瘤内有大量CDs+T淋巴细胞浸润,阳性产物主要呈现在细胞膜上并被染成棕褐色.B、C组内仅见少量CD8+T淋巴细胞.结论 甲醛固定的H22细胞联合IL-2具有延迟荷瘤小鼠H22肝癌形成,限制生长的作用.     

弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞和NK细胞的影响

目的探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对B16F10黑素瘤小鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用。方法将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型。采用ESA腹腔注射进行干预,将实验小鼠分为4组：PBS组、B16F10组、PBS＋ESA组、B16F10＋ESA组,分别于ESA干预后2、4、6d取脾,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞和NK细胞占脾细胞的比例;WST-8法检测各组小鼠CD4＋CD25＋T细胞对CD4＋CD25-T细胞增殖的抑制功能;LDH法检测NK细胞杀伤B16F10功能;观测荷瘤鼠肿瘤体积动态变化。结果 ESA干预4、6d后,荷瘤鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞占脾细胞的比例分别为（1.65±0.18）%和（1.56±0.17）%,与荷瘤对照组[分别为（2.47±0.10）%和（2.82±0.12）%]比较差异均有统计学意义（P均〈0.05）;ESA干预可使CD4＋CD25＋T细胞对CD4＋CD25-T细胞的抑制功能下降。抑制作用以干预后4、6d较明显,抑制率分别为50.03%和50.00%,低于荷瘤对照组的75.03%和78.14%（P均〈0.05）;荷瘤鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例[（3.58±0.07）%]在ESA干预后6d显著高于荷瘤对照组的（2.61±0.13）%（P〈0.05）。同时NK细胞杀伤B16F10细胞功能也增强,不同效靶细胞比（5∶1、10∶1、20∶1）下分别为26.51%、35.25%、60.19%,明显高于荷瘤对照组的16.81%、24.63%、45.62%（P均〈0.05）;ESA干预后,瘤体出现延缓生长,平均出瘤时间较对照组延迟6d,实验终点荷瘤第35天ESA干预组瘤体体积[（6208.34±443.64）mm3]明显小于荷瘤对照组[（9027.46±1362.01）mm3]（P〈0.05）。结论弓形虫ESA可通过下调荷瘤鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞比例并抑制其功能和上调NK细胞比例并增强其杀伤功能,发挥抗肿瘤作用。     

刚地弓形虫排泄分泌抗原刺激NK细胞过继转输对小鼠B16F10黑色素瘤生长的抑制作用

目的观察刚地弓形虫排泄分泌抗原(Tg ESA)刺激后的NK细胞对小鼠B16F10黑色素瘤生长的作用。方法取弓形虫RH株体外培养12 h后,从培养上清收集获得弓形虫ESA。取10只C57BL/6小鼠随机分为2组,每组5只,每只小鼠右腋窝皮下接种B16F10黑素瘤细胞2×10~5个。接种后第7天,随机取1组小鼠腹腔注射100μl Tg ESA,另1组注射等量的PBS。接种后第14天,无痛处死小鼠,无菌条件下制备小鼠脾细胞悬液,分离2组荷瘤鼠的NK细胞,分别记为NK_(B16F10)和NK_(ESA),用于后续过继转输实验。取30只C57BL/6小鼠随机分为对照组、 NK_(B16F10)组和NK_(ESA)组,每组10只。3组小鼠均右腋窝皮下接种B16F10细胞2×10~5个/鼠。其中NK_(B16F10)组和NK_(ESA)组小鼠同时分别尾静脉注射2×10~5个NK_(B16F10)和NK_(ESA)。观察瘤体生长情况以及各组小鼠死亡数和死亡时间,共观察35 d。结果 NK细胞过继转输后,NK_(ESA)组和NK_(B16F10)组小鼠平均出瘤时间分别为(14.70±0.95)、(12.60±0.70) d,均晚于对照组的(8.50±0.85) d (P 0.05)。3组小鼠出瘤后,瘤体均不断增长,至第35天,NK_(B16F10)组和NK_(ESA)组的平均瘤体面积分别为(686.53±17.84)和(577.79±49.70) mm~2,均小于对照组的(787.84±19.94) mm~2 (P 0.05)。对照组、 NK_(B16F10)组和NK_(ESA)组小鼠分别于接种B16F10细胞后第24、 27和30天开始出现死亡,至第35天,存活的小鼠数分别为3、 4和6只。结论弓形虫ESA刺激的NK细胞过继转输小鼠后可较为明显地抑制B16F10黑色素瘤瘤体的生长。     

人蛔虫提取物对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用北大核心CSCD

为探讨人蛔虫提取物对肿瘤的作用及其免疫学机制,将45只C57BL/6小鼠随机分为A、B、C、D和E等5组,每组9只,其中B、D组分别为A、C组的实验对照组,E组为阴性对照组,不做任何处理。A组每鼠隔天腹腔注射0.1 ml蛔虫提取物(BEAL),10 d后每鼠右前肢腋下皮下接种0.1 ml Lewis肺癌细胞(LLC),进行肿瘤造模;B组小鼠注射等量生理盐水,10 d后进行肿瘤造模。C组每鼠注射0.1 ml LLC细胞悬液进行肿瘤造模,2 d后腹腔注射0.1 ml BEAL,隔天1次,共注射5次;D组小鼠肿瘤造模2 d后,注射等量生理盐水,隔天1次。记录各组小鼠成瘤时间,称瘤重,计算抑瘤率。结果显示,A、B、C和D组小鼠的成瘤时间分别为(7.0±1.1)、(6.0±0.7)、(9.0±1.2)和(7.0±0.9)d。BEAL提前干预的A组小鼠肿瘤重量为(722.2±413.5)mg,显著重于其对照组B组[(338.9±282.2)mg](P<0.05)。小鼠荷瘤后BEAL干预的C组抑瘤率最强,为33.3%,其肿瘤重量[(237.8±101.8)mg]明显轻于对照组D组[(356.7±176.9)mg](P<0.05)。提示BEAL可影响肿瘤的形成,在一定条件下具有明显的抑瘤作用。     

抗CD25抗体联合瘤苗抗肿瘤作用的实验研究

将雌性C57BL/6小鼠随机分为抗CD25抗体 未接种瘤苗(A组)、抗CD25抗体 接种瘤苗(B组)、磷酸盐缓冲液(PBS) 未接种瘤苗(C组)和PBS 接种瘤苗(D组)四组,用流式细胞术检测小鼠尾静脉注射抗CD25抗体前后的CD 4CD 25调节性T细胞(Treg细胞)变化,用丝裂霉素灭活的肿瘤细胞免疫小鼠,观察其抗肿瘤能力(包括出瘤时间、肿瘤生长速度和生存期);用乳酸脱氢酶杀伤试验验证抗CD25抗体增强细胞毒T淋细胞的杀伤活性及特异性.结果 A组和C组CD 4CD 25Treg细胞百分比有统计学差异(P<0.05).接种瘤苗后第13天,A、C组及B、D组肿瘤发生率分别为25%、75%、0和25%,两两比较均有统计学意义(P均<0.05);接种后第5、13、18天,A、C、D组分别发生出瘤现象,B组最终未见肿瘤,A、C组间及B、D组间比较均有统计学差异(P均<0.05).B、D组脾脏细胞杀伤活性有统计学差异(P<0.05),并具有特异性.提示抗CD25抗体可降低CD 4CD 25Treg细胞,增强其抗肿瘤免疫作用,联合接种瘤苗可增强其抗肿瘤攻击的能力.     

旋毛虫抗小鼠体内SP2/0肿瘤作用的研究

目的观察旋毛虫感染对BAlB/c小鼠体内SP2/0瘤细胞生长的抑制作用。方法用不同剂量、不同方法致弱的旋毛虫感染BALB/c小鼠,在不同时间接种SP2/0细胞,于荷瘤后20 d解剖小鼠,测定小鼠体内肿瘤的体积、重量和无瘤生长小鼠比率,检测T淋巴细胞亚群。结果1)未致弱组、紫外线致弱组和60Co致弱组小鼠肿瘤体积和重量均显著低于对照组(P<0.01),CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05);无瘤生长小鼠比率显著高于对照组;2)接种750条、500条和250条旋毛虫组肿瘤体积和重量均显著低于对照组(P<0.01),CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05),无瘤生长小鼠比率显著高于对照组;3)接种3 d1、1 d和21 d后荷瘤组的肿瘤体积和重量均显著低于对照组(P<0.01),CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05),无瘤生长小鼠比率显著高于对照组。结论未致弱的旋毛虫和经不同方法致弱的旋毛虫对BALB/c小鼠体内的SP2/0骨髓瘤细胞的生长均有抑制作用,接种剂量增加,抑瘤效果越明显,但对实验动物的机体损伤也加重。接种11 d后荷瘤组的抑瘤效果好于接种3 d后荷瘤组和21d后荷瘤组。     

蜂王浆冻干粉对荷瘤小鼠营养状况的影响

目的 探讨蜂王浆冻干粉对荷瘤小鼠营养状况的影响.方法 选择30只BALB/c-nu/nu小鼠,随机分为空白对照组、荷瘤对照组和蜂王浆组,每组10只.荷瘤对照组、蜂王浆组分别皮下接种生长良好的人乳腺癌MCF-7细胞悬液建立皮下移植瘤模型.成模后,蜂王浆组给予蜂王浆冻干粉0.25 g+0.8 mL生理盐水,空白对照组、荷瘤对照组仅给予0.8 mL的生理盐水,连续灌胃20 d.观察灌胃期间小鼠体质量及摄食量变化,每2d测量肿瘤结节,计算肿瘤体积.并观察灌胃20 d后各组血生化指标.结果 两组荷瘤小鼠的总摄食量、总能量均低于空白对照组(P均＜0.01);蜂王浆组接种15 d荷瘤小鼠体质量低于空白对照组(P均＜0.05),接种22 d与空白对照组比较差异无统计学意义.蜂王浆冻干粉灌胃20d后,蜂王浆组红细胞、血红蛋白均高于荷瘤对照组(P＜0.05).实验期间,两组荷瘤组小鼠瘤体平均体积比较差异无统计学意义.结论 蜂王浆冻于粉能在一定程度改善荷瘤小鼠的营养不良.     

旋毛虫抗小鼠体内A549肺癌细胞作用的研究

目的观察旋毛虫对BALB／c小鼠体内A549瘤细胞生长的抑制作用。方法将实验小鼠（BALB／c）随机分为7组，每组10只，1～6组分别接种未处理或不同方法处理的旋毛虫，在不同时间段接种A549细胞。7组为不接种旋毛虫对照组。荷瘤后第30d解剖小鼠，测定小鼠体内肿瘤的体积、重量和无瘤生长小鼠比率，检测T淋巴细胞亚群变化。结果未处理旋毛虫接种组，紫外线处理及^60Co处理旋毛虫接种组小鼠肿瘤体积和重量均显著低于未接种对照组（P〈0．01），脾脏CD3＋、CD4＋、CD8＋百分率、CD4＋／CD8。比值及无瘤生长小鼠比率显著高于未接种对照组（P（0．05或P〈0．01）；接种前7d和接种后11d荷瘤组小鼠的肿瘤体积、重量均显著低于未接种对照组（P〈0．01），脾脏CD3＋、CD4＋、CD8＋百分率及CD4＋／CD8＋比值显著高于未接种对照组（P〈0．05）。结论未处理旋毛虫和经不同方法处理的旋毛虫对BALB／c小鼠体内的A549肺癌细胞的生长均有抑制作用，接种11d后荷瘤组的抑瘤效果更显著。     

重组减毒沙门氏菌疫苗SL3261-pcDNA3.1+/flk-1(n1-4)抗小鼠大肠癌的生长

目的:研究VEGFR2胞外1-4片段(flk-1(n1-4))抑制肿瘤生长效应.方法:构建DNA疫苗SL3261-pcDNA3.1 /flk1(n1-4),经ig饲服BALB/c小鼠,随机分为3组,疫苗组,载体对照组和NaHCO3对照组.对小鼠进行基因免疫.ELISA检测小鼠血清中VEGF水平及特异性抗flk-1(n1-4)-IgG抗体.流式细胞仪分析免疫小鼠淋巴细胞亚群.DNA疫苗免疫结肠癌荷瘤BALB/c小鼠,测量免疫后荷瘤小鼠肿瘤大小,检测肿瘤微血管密度.结果:免疫小鼠血清中VEGF水平明显降低,并产生高水平的抗flk-1(n1-4)-IgG抗体.免疫后荷瘤小鼠CD4 T、CD8 T值维持较高水平,小鼠结肠腺癌皮下肿瘤生长与载体和NaHCO3对照组相比明显受抑制,疫苗组小鼠肿瘤质量、体积、平均微血管密度与载体和NaHCO3对照组相比明显降低(3.64±1.34 g vs 8.40±0.66 g,8.26±0.44 g;2.62 ±0.54 mm3 vs 6.01±0.14 mm3,5.92±0.25 mm3,2.06±1.02 vs 6.93±2.34,7.34±4.12;P＜0.05).疫苗组小鼠中位生存期较两对照组明显延长.结论:flk-1(n1-4)能够抑制肿瘤血管内皮细胞生长,达到抗大肠癌生长作用.     

GM-CSF分泌型肝癌疫苗对荷瘤鼠脾血细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性的影响

目的观察粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型肝癌疫苗对移植性肝癌小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的影响。方法取小鼠肝癌细胞株H22细胞1×106/只注入小鼠腹腔内,接种7d形成腹水瘤后再在小鼠体内传3代。取生长旺盛且无血性的腹水,在无菌条件下制成2×107/ml的细胞悬液,以2×106细胞/0.1ml/只接种于小鼠右前肢皮下。将肝癌细胞移植瘤动物分成3组。4天后,在右侧背部皮下进行免疫治疗,即制备GM-CSF分泌型H22肝癌瘤苗并免疫ICR小鼠(H22-GM-CSF组,n=5),同时设立无GM-CSF基因修饰H22肝癌瘤苗组(H22组,n=5)和PBs对照组(PBS组,n=5),测量各组小鼠肿瘤体积;采用细胞增殖计数法检测小鼠脾血CTL杀伤活性。结果随着效/靶比增加,各组CTL杀伤活性均增强。在效/靶比为50∶1时,GM-CSF-H22组CTL杀伤活性为60±6.1%,明显高于H22组(17.4±0.9%)和PBS组(12.2±0.6%,P<0.01);GM-CSF分泌型肝癌细胞瘤苗明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长。在21天时,H22-GM-CSF组、H22组和PBS组小鼠肿瘤体积分别为0.63±0.05mm3、1.47±0.75mm3和1.79±0.34mm(3P<0.01)。结论 GM-CSF分泌型肝癌细胞瘤苗可抑制肿瘤细胞生长,增强CTL杀伤活性。     

旋毛虫抗小鼠体内SP2／0肿瘤作用的研究

目的观察旋毛虫感染对BAIB／c小鼠体内SP2／0瘤细胞生长的抑制作用。方法用不同剂量、不同方法致弱的旋毛虫感染BALB／c小鼠，在不同时间接种SP2／0细胞，于荷瘤后20d解剖小鼠，测定小鼠体内肿瘤的体积、重量和无瘤生长小鼠比率，检测T淋巴细胞亚群。结果1）未致弱组、紫外线致弱组和^60Co致弱组小鼠肿瘤体积和霞量均显著低于对照组（P〈0．01），CD4^＋／CD8^＋显著高于对照组（P〈0．05）；无瘤生长小鼠比率显著高于对照组；2）接种750条、500条和250条旋毛虫组肿瘤体积和重量均屁著低于对照组（P〈0．01），CD4^＋／CD8^＋硅著高于对照组（P〈0．05），元瘤生长小鼠比率显著高于对照组；3）接种3d、11d和21d后荷瘤组的肿瘤体积和雨量均品著低于对照组（P〈0．01），CD4^＋／CD^8＋显著高于对照组（P〈0．05），无瘤生长小鼠比率显著高于对照组。结论未致弱的旋毛虫和经不同方法致弱的旋毛虫对BALB／c小鼠体内的SP2／0骨髓瘤细胞的生长均有抑制作用，接种剂量增加，抑瘤效果越明显，但对实验动物的机体损伤也加重。接种11d后荷瘤组的抑瘤效果好于接种3d后荷瘤组和21d后荷瘤组。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠人食管鳞癌移植瘤的抑制作用

目的 研究乙酰肝素酶(Hpa)抑制剂反义脱氧寡核苷酸(ASODN)对食管癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤作用.方法采用低分化食管鳞癌细胞TE-13接种裸鼠,构建食管癌皮下侵袭模型,随机分为1mg/kg ASODN组(A组)、2mg/kg ASODN组(B组)和生理盐水(NS,2ml/kg)对照组(C组),每组5只,分别在肿瘤接种区皮下注射相应剂量的ASODN和NS.观察肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD),采用RT-PCR和免疫组化染色检测移植瘤中Hpa的表达.结果接种后第6天,所有裸鼠在接种部位均长出肿瘤.接种后第21天,A、B组肿瘤体积较C组明显缩小(P<0.01),A、B组抑瘤率分别为50.27%和49.67%.A、B组MVD较c组明显降低(P<0.01).A、B、C组Hpa mRNA阳性表达分别为0.43±0.01、0.45±0.12、1.33±0.05,Hpa蛋白阳性表达分别为45.60±4.57、43.40±7.80、121.20±11.90.A、B组Hpa mRNA、蛋白表达均较C组降低(P<0.01).结论应用ASODN可以抑制肿瘤生长,其作用机制可能在于抑制肿瘤Hpa mRNA、蛋白合成,从而抑制肿瘤血管新生.2mg/kg与1mg/kg Hpa ASODN比较,未能显示更强的抑瘤效果.     

细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠LncRNA 031520表达的研究

目的探讨长链非编码RNA031520(LncRNA 031520)分子在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15诱导小鼠免疫保护的表达分析。方法 36只雌性BALB/c小鼠分为PBS对照组、弗氏佐剂组和ZW-15免疫组,12只/组。PBS对照组、弗氏佐剂组分别皮下多点注射PBS溶液和完全/不完全弗氏佐剂100μl/只,ZW-15免疫组注射重组抗原100μl/只(10μg/只)。弗氏佐剂组和ZW-15免疫组初次免疫使用完全弗氏佐剂,加强免疫使用不完全弗氏佐剂。共免疫3次,初次免疫后的2次加强免疫间隔时间为两周。免疫小鼠经麻醉取血,分离血清。采用ELISA法检测特异IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平。无菌取脾脏,分离淋巴细胞采用流式细胞术分选CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞及B淋巴细胞群;利用qRT-PCR检测CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞、B淋巴细胞及总淋巴细胞中LncRNA 031520及内参GAPDH的表达;利用流式细胞术检测脾脏CD4~+T淋巴细胞中IFN-γ、IL-4的表达。使用SPSS 17.0统计软件和Graphpad Prism 8.0绘图软件对实验数据进行统计分析。结果小鼠经亲肌肉重组抗原ZW-15免疫后血清特异IgG、IgG1、IgG2a及IgG2b抗体水平均升高,且均显著高于PBS组、弗氏佐剂对照组,差异均有统计学意义(P0.001)。LncRNA 031520在ZW-15免疫组CD4~+T淋巴细胞、总淋巴细胞中相对表达量显著高于PBS对照组和弗氏佐剂对照组(P0.01),在ZW-15免疫组B淋巴细胞及CD8~+T淋巴细胞中相对表达量与PBS对照组及弗氏佐剂对照组相比差异均无统计学意义(均P0.05)。免疫组小鼠脾脏淋巴细胞Th1亚群标志分子IFN-γ表达量为(19.07±3.44)%,显著高于PBS对照组(8.03±2.67)%和弗氏佐剂对照组(9.37±1.25)%(P0.05),Th2亚群标志分子IL-4表达量为(0.79±0.02)%,显著高于PBS对照组(0.44±0.13)%和弗氏佐剂对照组(0.50±0.15)%(P0.05)。结论 LncRNA 031520在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠淋巴细胞中表达上调,可能在亲肌肉抗原抵御细粒棘球蚴感染中发挥免疫保护作用。     

约氏疟原虫感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用

目的观察约氏疟原虫17XL虫株感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用。方法取C57BL/6小鼠20只,腋下注射传代培养的B16F10黑色素瘤细胞;次日,将小鼠随机分为约氏疟原虫(P.y)感染组和对照组2组,10只/组;P.y感染组小鼠每只腹腔注射1×106个含虫红细胞率为20%的小鼠红细胞;对照组小鼠腹腔注射等量的C57BL/6小鼠正常红细胞。观察两组小鼠黑色素瘤出瘤时间并测量肿瘤的体积。结果 P.y感染组小鼠黑色素瘤出瘤时间为注射黑色素瘤细胞后(11.30±0.21)d,晚于对照组[(10.40±0.22)d](P0.05);自可精确测量瘤体起至实验终点,2组小鼠肿瘤均不断增长,P.y感染组瘤体体积均显著小于对照组(P均0.05);P.y感染组瘤体生长速度为(71.10±6.29)mm3/d,明显慢于对照组[(302.80±49.94)mm3/d](P0.05),且P.y感染组肿瘤每日生长速度亦明显慢于对照组(P均0.05)。结论约氏疟原虫感染可以延缓肿瘤出瘤时间,且对小鼠黑色素瘤瘤体的增长具有明显的抑制作用。     

肝组织内序贯注射灭活异体淋巴细胞和自体淋巴细胞治疗小鼠肝癌移植瘤的研究

目的探讨用异体淋巴细胞(heterogeneic lymphocyte,HL)和自体淋巴细胞(autogeneic lymphocyte,AL)序贯注射的抗肿瘤方法。方法取供鼠C3H小鼠脾淋巴细胞,用丝裂霉素灭活制备灭活异体淋巴细胞(inactivated HL,IHL)。在受鼠CB6F1小鼠肝组织内接种hepa1-6瘤细胞。用冻融法从小鼠血浆提取冷沉淀,制成纤维蛋白胶(fibrin glue,FG);用FG与IHL或AL组合成FG-IHL或FG-AL。前阶段:用FG-IHL注射到荷瘤受鼠肝内肿瘤接种部位治疗(实验组);用FG-PBS同法注射受鼠肝内肿瘤接种部位作为对照组。而后检测两组受鼠的脾淋巴细胞杀瘤细胞率和脾淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞、NK细胞数量等免疫学指标。后阶段:从实验组、对照组中随机选出部分受鼠,取淋巴细胞制成FGAL,将各组FG-AL分别注射到本组其余受鼠的肝内肿瘤接种部位;治疗后剥出受鼠肝内肿瘤,比较两组的瘤体积和抑瘤率。结果前阶段治疗后,实验组受鼠AL的杀瘤细胞率为(25.7±4.81)%,明显高于对照组AL的相应值(E∶T=60∶1,P0.01);实验组受鼠脾淋巴细胞、CD8~+T细胞和NK细胞数量均明显高于对照组的相应值(均P0.05)。经前、后两阶段治疗后,实验组受鼠的瘤平均体积为(1.15±0.25)cm~3,明显小于对照组的瘤平均体积为(1.91±0.37)cm~3(P0.01);实验组的抑瘤率为39.8%(以对照组作基准)。结论肝组织内肿瘤局部注射IHL,再注射AL的序贯疗法,可明显抑制小鼠移植肝肿瘤生长,有望成为一种抗肿瘤生物疗法。     

多房棘球蚴感染小鼠脾CD4~+T细胞亚群及其功能耗竭的变化

目的研究不同数量多房棘球蚴感染对小鼠脾CD4~+T细胞亚群及其免疫功能的影响。方法60只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组15只,分别为假手术组、低数量感染组(50个原头节)、中数量感染组(500个原头节)和高数量感染组(2 000个原头节)。小鼠麻醉后经肝门静脉部位穿刺,注射不同数量原头节,假手术组注射等量生理盐水。于感染后2、 12和24周各组分别取5只小鼠,取脾组织研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测各组小鼠脾CD4~+T细胞记忆表型、不同亚群比例、免疫抑制性分子淋巴细胞活化蛋白3 (LAG3)表达。采用GraphPad Prism 6.0软件进行作图和统计学分析。结果感染后2周,低数量和中数量感染组小鼠脾CD4~+IFN-γ~+T细胞比例分别为(7.54±1.44)%、(7.58±3.17)%,高于假手术组的(3.52±1.03)%(P 0.05);CD4~+TNF-α~+T细胞比例分别为(39.34±4.19)%、(39.53±10.74)%,高于假手术组(22.62±1.50)%(P 0.01)。感染后12周,低数量和中数量感染组小鼠脾CD4~+IFN-γ~+T细胞比例分别为(16.52±0.77)%、(22.98±4.32)%,高于假手术组(16.88±2.49)%(P 0.05); CD4~+TNF-α~+T细胞比例分别为(27.26±2.12)%、(28.36±5.24)%,高于假手术组(19.72±3.87)%(P 0.05); CD4~+IL17A~+T细胞比例分别为(10.70±1.81)%、(11.52±2.68)%,高于假手术组(5.40±1.32)%(P 0.01);同时,低数量和中数量感染组小鼠脾CD4~+IL-4~+T细胞比例分别为(2.87±0.84)%、(3.50±0.77)%,高于假手术组(1.75±0.83)%(P 0.01); CD4~+IL-10~+T细胞比例分别为(4.63±0.78)、(7.09±2.42)%,高于假手术组(3.03±0.79)%(P 0.01)。感染后24周,中数量、高数量感染组小鼠脾CD4~+IFN-γ~+T、 CD4~+TNF-α~+T、 CD4~+IL-4~+T、 CD4~+IL-10~+T和CD4~+IL17A~+T细胞的比例均高于假手术组(P 0.05),且高数量组小鼠脾Treg细胞的比例高于假手术组(P 0.01),各感染组小鼠脾效应记忆性CD4~+T细胞比例高于假手术组;各感染组小鼠脾CD4~+LAG3~+T细胞比例分别为(16.45±4.89)%、(14.54±4.96)%、(14.62±2.43)%,高于假手术组(8.43±3.46)%(P 0.05)。感染后24周,高数量组小鼠脾CD4~+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的LAG3阳性群细胞比例分别为(1.67±0.66)%、(0.69±0.27)%,低于阴性群的(5.11±1.81)%、(31.7±12.1)%(P 0.01)。结论低、中数量多房棘球蚴感染后,小鼠可能利用T1型和T17型免疫应答优势对虫体起到杀伤和清除;而高数量感染诱导脾T1/T2型和T17/Treg型免疫应答失衡,以及CD4~+T细胞上调LAG3分子表达,导致功能耗竭,造成棘球蚴慢性寄生。     

经沉默免疫负调控基因技术处理的树突状细胞联同细胞毒性T淋巴细胞对HepG2细胞移植瘤的抑制作用

目的观察经沉默免疫负调控基因(iAPA)技术处理的树突状细胞(DC)联同细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(iAPA-DC/CTL)对HepG2细胞移植瘤的抑制作用。方法利用人肝癌细胞系HepG2建立裸鼠皮下移植瘤模型,将12只裸鼠随机分为2组:生理盐水对照组(C组)和iAPA-DC/CTL组(DC组),每组6只,行iAPA-DC/CTL治疗4次(1周/次)后处死。实验期间观察各组裸鼠的肿瘤生长,测量肿瘤长短径并描绘肿瘤生长曲线,称量瘤重并计算抑瘤率,病理检测。两组间均数比较采用成组t检验。结果造模成功率为92.31%。C组和DC组肿瘤体积分别为:(697.69±143.99)、(485.64±188.75)mm3,DC组生长相对缓慢(t=2.28,P0.05);C组和DC组肿瘤重量分别为:(0.32±0.07)、(0.22±0.08)g,DC组肿瘤重量小于对照组(t=2.31,P0.05),抑瘤率为30.39%。肿瘤免疫组化染色后T淋巴细胞计数分别为:C组未见、DC组(39.74±5.11)个/高倍视野,DC组肿瘤内T细胞数多于对照组(t=19.05,P0.05)。结论 iAPA-DC/CTL能够有效抑制HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。     

日本血吸虫感染小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞及其表面程序性死亡配体1表达动态变化的研究

目的初步研究日本血吸虫感染对小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞数量及其表面程序性死亡配体1(PD-L1)功能的影响。方法 30只BALB/c小鼠随机分为感染组和未感染组,每组15只,感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(20±2)条/鼠。感染后2、 4、 6、 8和10周,分别随机取两组小鼠各3只,颈椎脱臼处死小鼠,分离小鼠肝脏和脾脏的淋巴细胞,采用流式细胞术检测CD3~+T细胞(CD3~+CD19~-)、 CD19~+B细胞(CD3~-CD19~+)、 CD4~+T细胞(CD3~+CD19~-CD4~+CD8~-)和CD8~+T细胞(CD3~+CD19~-CD4~-CD8~+)淋巴细胞比例的动态变化,以及这些细胞群上的PD-L1表达变化。组间差异比较采用ANOVA检验。结果感染日本血吸虫后4～8周,小鼠肝脏和脾脏中的CD3~+T细胞、 CD19~+B细胞和CD4~+T细胞比例均低于未感染组(P 0.05或0.01,P 0.05)。感染日本血吸虫后6周的小鼠肝脏中CD8~+T细胞比例增加[(38.03±7.41)%],与未感染组[(23.37±3.98)%]比较,差异有统计学意义(P 0.01);但脾脏中无明显变化。在感染日本血吸虫后6周,小鼠肝脏中CD19~+B细胞上PD-L1的表达被显著抑制[(7.25±3.47)%],与未感染组[(22.77±8.90)%]比较,差异有统计学意义(P 0.01);脾脏相对肝脏较晚,感染后8周CD19~+B细胞上PD-L1的表达被抑制[(22.37±4.01)%],与未感染组[(51.97±1.62)%]比较,差异有统计学意义(P 0.01),且此后在肝脏和脾脏中保持低水平表达。感染后2～10周,肝脏中的CD3~+T和CD4~+T细胞表面PD-L1的表达低于未感染组(P 0.05或0.01, P 0.05),脾脏中的CD3~+T和CD4~+T细胞表面PD-L1的表达分别于感染后4～8周和6～10周低于未感染组(P 0.05)。肝脏和脾脏中CD8~+T细胞上PD-L1的表达在感染早期无变化,感染后10周比例增加,为(34.80±3.68)%、(31.90±2.53)%,与未感染组[(25.5±0.80)%、(29.91±3.55)%]比较,差异有统计学意义(P 0.01)。结论日本血吸虫感染BALB/c小鼠后,肝脏和脾脏中CD19~+B、 CD3~+T和CD4~+T淋巴细胞亚群的比例显著降低,但对CD8~+T细胞比例影响不明显。感染对PD-L1在上述淋巴细胞亚群的表达也有相同的变化,在CD19~+B、CD3~+T和CD4~+T细胞上表达受抑制,在CD8~+T细胞上的表达影响较小,且肝脏局部淋巴细胞的变化早于脾脏。     

白介素18和胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌的联合基因治疗

目的观察白介素18和胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌MM45T.Li联合基因治疗的效果.方法将小鼠IL-18基因克隆入pGCEN中,构建成pGCEN/IL-18.包装成逆转录病毒,感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li,制出具有生物活性的MM45T.Li/IL-18瘤苗,灭活后对荷瘤小鼠进行皮下接种.同时利用AdCD/5FC对小鼠肝癌原位注射,进行联合基因治疗.结果在接受治疗30d后,MM45T.Li对照组肿瘤体积1580～1625mm3,MM45T.Li/IL-18治疗组(366±159)mm3,AdCD/5FC治疗组(438±65)mm3,IL-18和AdCD/5FC联合治疗组体积(15±7)mm3(P＜0.05).MM45T.Li对照组中位生存期50.0～51.5d,MM45T.Li/IL-18治疗组65d,AdCD/5FC治疗组57d,联合治疗组76d,和单独治疗组相比,联合治疗组中位生存期明显延长(P＜0.05).联合基因治疗组肿瘤组织周围有更多CD4+及CD8+淋巴细胞浸润.结论IL-18和CD基因的联合治疗组,其疗效要明显好于IL-18或CD基因单独治疗组.进行联合基因治疗,既有效地减少了肿瘤负荷,又充分调动了机体的抗肿瘤免疫,提高了疗效.     

加载野生型p53基因鼠树突细胞的抗肿瘤作用

目的 观察加载了野生型p53基因的树突细胞(DC)对不同位点p53基因突变肿瘤得庖咧瘟谱饔?方法通过锥虫蓝染色、同种异体混合白细胞反应及流式细胞仪检测DC细胞表面分子,评估腺病毒(Ad)-p53感染DC是否影响DC的免疫功能.以Ad或转导了野生型p53基因的Ad分别感染骨髓De(Ad-DC和Ad-p53-DC)后,静脉注射免疫C57BL/6小鼠各5只,分离脾细胞,采用标准6 h51 Cr释放试验测定其诱导不同肿瘤细胞系(MethA、D459和P815)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性;效应细胞(Ad-p53-DC免疫后的小鼠脾细胞)和靶细胞(Ad-p53-P815和D459)孵育时分别加入抗CD4抗体或抗CD8抗体,观察CTL的活性变化.使用MethA和D459肿瘤细胞系得到不同的荷瘤鼠,于肿瘤形成前后分别使用Ad-p53-DC免疫,Ad-DC对照,当实体瘤三维直径之和＞20 cm时处死小鼠,用生存曲线评估Ad-p53-DC免疫的预防或治疗作用.结果 (1)Ad-p53-DC免疫诱导的抗Ad-p53-P815、D459和MethA的CTL反应(效应细胞:靶细胞=50:1)分别为(27.8±3.4)%、(23.5±2.7)%及(58.3±9.2)%,与Ad-DC免疫诱导的反应[(9.3±1.8)%、(4.6±1.0)%及(23.5 ±3.7)%]相比,差异有统计学意义(td值分别为5.79、3.68、5.02,均P＜0.05).Ad-p53-DC免疫小鼠T淋巴细胞与靶细胞Ad-p53-P815或D459的CTL活性,抗CD4组[(59.8 ±4.6)%、(18.9±2.4)%]与无抗体组[(64.4±6.3)%、(22.2±3.0)%]相比,差异无统计学意义(td值分别为0.84、0.91,均P＞0.05),而抗CD8组[(26.7±2.8)%、(6.1±1.2)%]差异有统计学意义(td值分别为9.03、7.67,均P＜0.05).抗CD8组与抗CD4组比较,差异有统计学意义(td值分别为8.79、9.18,均P＜0.05).(2)Ad-p53-DC和Ad-DC静脉注射2次免疫小鼠后,分别以D459细胞或MethA肉瘤细胞荷瘤20只小鼠.在Ad-p53-DC免疫组分别有14只和16只小鼠肿瘤的生长得到完全抑制,与Ad-DC免疫组比较差异有统计学意义(x2值分别为6.72、5.86,P＜0.05).皮下接种小鼠D459后,Ad-p53-DC免疫治疗组的小鼠肿瘤生长速度比Ad-DC组延缓2周左右,二组比较差异有统计学意义(x2 值为9.48,P＜0.05).结论 Ad-p53-DC可诱导抗MethA、P815和D459靶细胞的由CD8+T淋巴细胞介导的CTL反应,并抑制鼠体内肿瘤细胞的形成和生长.