siRNA对HEK293细胞WT1表达的抑制作用及对K562细胞增生的影响

目的探讨以WT1基因为靶标治疗白血病的可行性,筛选有效抑制WT1基因表达的siRNA并观察其对K562细胞增生的影响。方法制备特异性WTi siRNA3条,转染HEK293细胞株,采用荧光定量RT—PCR方法检测WT1基因mRNA表达,Westernblotting法检测WT1蛋白表达;M1Tr法检测细胞增生的影响。结果不同位点的siRNA对WT1基因抑制作用不同。si—wt1-1对WT1mRNA抑制明显（P〈0．05）,si—wt1-2、si—wt1-3对WT1mRNA无抑制（P〉0．05）。100nmol／L si—wt1—1能使WT1mRNA的表达在转染后24h和48h分别降低至对照组的（42．5±1．0）％（P〈0．05）、（25.3±1．5）％（P〈0．01）,但72h恢复至对照组水平。siRNA作用无明显剂量依赖性,不同浓度si—wt1-1对WT1mRNA抑制作用的比较差异无统计学意义（P〉0．05）。Westernblotting法检测证实转染siRNA48、72、96h后,si—wt1-1对WT1蛋白抑制明显（P〈0．05）,且96h抑制作用最强;si—wt1-2、si—wt1-3无明显抑制作用（P〉0．05）。si—wt1-1对K562细胞增生有抑制作用,si—wt1-1处理组与阴性对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA可有效抑制HEK293细胞WT1基因的表达,且mRNA水平抑制效果优于蛋白水平。si—wt1-1可有效抑制K562细胞的增生。     

WT1反义寡核苷酸对K562白血病细胞生长抑制作用研究

 目的 探讨WT1反义寡核苷酸（WT1-ASO）对白血病细胞生长抑制作用。方法 合成一段与WT1基因转录本翻译起始序列互补的、含18个碱基的WT1反义寡聚核苷酸序列,以200 μg／ml与白血病细胞系K562和U937共培养,同时设立WT1-SO组及单纯培养基对照组,锥虫蓝拒染实验确定活细胞数,测定细胞生长曲线,观察WT1-ASO对白血病细胞生长抑制作用,实时定量RT-PCR技术检测相应细胞系中WT1基因表达水平变化。结果 WT1-ASO能够特异性抑制WT1表达的K562细胞的生长,与WT1-SO组及对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）,而WT1-ASO对WT1低表达的U937细胞生长无明显抑制作用,WT1-ASO能够特异性下调K562细胞中WT1基因表达水平。结论 WT1-ASO能够特异性抑制表达WT1基因的白血病细胞生长,下调其WT1基因表达,可以应用于白血病治疗。     

人血管内皮生长因子shRNA对小鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的：使用VEGF shRNA真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射,观察对其生长影响。方法：使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,观察VEGF shRNA真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射后负瘤的生长变化。结果：VEGF shRNA大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,裸鼠的负瘤生长速度变慢。结论：VEGF shRNA可明显使裸鼠的负瘤生长速度变慢,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

槲皮素对K562细胞生长及血管内皮生长因子分泌的影响

 目的 探讨槲皮素对K562细胞的形态、血管内皮生长因子（VEGF）的表达影响。方法 以K562细胞为研究对象,细胞形态学观察采用Wright染色法;AnnecxinⅤ标记检测细胞凋亡率;VEGF表达采用ELISA法。结果 经槲皮素处理后,细胞形态学上出现凋亡特征性改变;槲皮素处理后K562细胞凋亡率明显增加;槲皮素处理后K562细胞显著降低VEGF的表达。结论 槲皮素在体外能抑制白血病细胞K562生长并诱导其凋亡;槲皮素可抑制白血病细胞分泌VEGF。     

靶向人类WT1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 制备编码人类WT1基因的shRNA(short hairpin RNA)质粒表达载体.方法 设计合成WT1shRNA的DNA模板单链,在两端加入限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,退火形成双链,质粒pGenesil-1的BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切线性化,稀释退火片段与线性化Pgenesil-1质粒表达载体经T4DNA连接酶连接,酶切、测序鉴定.结果 经酶切、测序鉴定,pWT1shRNA构建成功.结论 成功构建了针对人类WT1基因的shRNA质粒表达载体,为探讨WT1的生物学功能及白血病的基因治疗奠定了基础.     

RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达

目的：应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法：将VEGF基因作为RNA干扰的靶区，通过E—RNAi网上提供的服务，设计两个特异的RNA干扰序列，将其装入含U6启动子的载体上，构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体，再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2，通过RT—PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果：成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体，RT—PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中，能明显抑制VEGF基因的表达，抑制率分别为72％和42％。但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28％和13％；Northern杂交显示，在HEK293细胞和HT29细胞中，VEGF mRNA明显受抑，抑制率达88％和89％；免疫荧光显示，在HT29细胞中，VEGF蛋白表达的受抑制率为73％。结论：针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达，但在不同细胞系中的作用强度存在差别。     

血管内皮生长因子的表达对人胃癌细胞生物学表型的影响

 目的　探讨血管内皮生长因子对人胃癌细胞生物学表型的影响。方法　将 VEGF16 5正、反义 RNA表达载体导入人胃癌细胞 ,并观察其细胞周期、增殖、裸鼠致瘤生长等生物学指标。结果　与 VEGF正义转染细胞相比 ,在反义转染细胞的细胞周期中 G1期细胞数增加了 1 7.3% ,而S期细胞减少了 43.6 % ;正义转染细胞的克隆形成率明显高于反义转染细胞 ;正义转染细胞组的肿瘤生长速度及瘤体积明显高于其他组。结论　 VEGF可以加强肿瘤组织血管生成 ;VEGF反义RNA可以防治肿瘤生长 ;VEGF可能与肿瘤细胞增殖能力有关.     

解毒维康片对HL-60白血病细胞血管内皮生长因子表达的影响

 目的 探讨中药复方制剂解毒维康片（JDWKP）对HL-60白血病细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 采用血清药理学方法,以大鼠为实验动物,制备出JDWKP的含药血清,再采用酶联免疫吸附法（ELISA法）,检测含药血清作用于HL-60细胞不同时间后培养上清中VEGF的含量。结果 JDWKP含药血清能以剂量依赖方式明显抑制HL-60细胞VEGF的表达,中等剂量含药血清处理HL-60细胞48 h,VEGF的浓度仅为阴性对照组的21.6 %,但进一步增高药物浓度或延长作用时间,VEGF浓度并无明显的相应改变。结论 JDWKP能下调HL-60细胞VEGF的表达水平,这可能是中药复方制剂JDWKP抗白血病的作用机制之一。     

儿童急性白血病骨髓细胞中血管内皮生长因子及其受体的表达

  目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）在儿童急性白血病（AL）患者骨髓中的表达,分析其在化疗前后的变化。方法 采用免疫组化S-P法检测53例AL患儿治疗前后以及对照组骨髓中VEGF／VEGFR（包括Flt-1和KDR两种）变化,分析其与临床特征的关系。结果 VEGF,Flt-1,KDR在AL患儿骨髓中表达水平高于对照组。VEGF,Flt-1,KDR的表达于化疗达完全缓解（CR）后下调;化疗后未获得CR患儿VEGF,Flt-1,KDR的表达在化疗前后差异无统计学意义。骨髓中VEGF,Flt-1,KDR的表达水平在不同年龄、性别、有无髓外浸润间差异无统计学意义。结论 VEGF,Flt-1,KDR在儿童AL中呈高表达,化疗后表达明显降低,说明VEGF可能作为评价儿童AL化疗反应的指标。     

下调VEGF表达影响鼻咽癌细胞放射敏感度的机制

目的　应用RNA干扰技术抑制人鼻咽低分化鳞状上皮细胞癌细胞株CNE-2中血管内皮生长因 子（VEGF）表达,研究阻断VEGF基因表达对鼻咽癌细胞放射敏感度的影响及机制。方法 构建针对 VEGF的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA（CNE-2组）、1个阴性对照质粒（CNE-2/Neg-siRNA 组）、经脂质体转染至CNE-2细胞（CNE-2/VEGF-siRNA组）,用平板克隆形成实验检测在6MV-X线 0、2、4、6、8、10 Gy照射后克隆形成能力及通过单击多靶模型、线性二次模型拟合放射生物学参 数,流式细胞检测分析细胞周期和细胞凋亡的变化,用RT-PCR定量分析三组细胞中Cyclin D1、Cyclin E、P16和P53的mRNA表达。结果 经6MV-X线0、2、4、6、8、10 Gy照射后细胞存活率显著下降, CNE-2/VEGF-siRNA组细胞经D0和2 Gy照射后的存活分数明显低于CNE-2组、CNE-2/Neg-siRNA组; CNE-2/VEGF-siRNA组中G1/S期细胞周期阻滞更为明显。在Cyclin D1、Cyclin E、p16和p53基因中, Cyclin D1mRNA表达在放疗后6、12和24 h进行性升高,差异有统计学意义,而其他基因变化差异无统 计学意义,Western blot检测显示Cyclin D1蛋白表达在放疗后24 h明显升高。结论 下调VEGF表达可 增加鼻咽癌细胞的放射敏感度,其机制可能是通过Cyclin D1信号通路途径使细胞周期发生G1/S期阻滞。     

RNA干扰沉默VEGF及其受体抗大肠癌血管生成研究进展

研究表明血管内皮生长因子(VEGF)及其受体在大肠癌血管生成中扮演重要角色.因此通过RNA干扰技术阻断大肠癌VEGF及其受体在大肠癌抗血管生成治疗中显示出良好的应用前景.     

血管内皮生长因子及其受体在白血病中的表达及作用

血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的表达,在白血病细胞的增殖和存活中发挥了重要作用.几乎所有类型的白血病均可见VEGF及其受体的表达,VEGF及其受体与白血病的预后及分期等密切相关.     

RNA干扰和伊马替尼杀伤K562细胞效果的比较

目的比较RNA干扰（RNAi）和伊马替尼（imatinib）杀伤K562细胞的效果。方法设计有效的bcr—abl干扰shRNA序列，利用基因工程技术插入到干扰载体构建RNAi质粒。测序鉴定正确的RNAi质粒转染K562细胞，48h后荧光显微镜观察转染效率。RT—PCR技术检测K562细胞中bcr—abl表达水平。同时，伊马替尼作用K562细胞。利用凋亡分析、MTT增生实验和磷酸化的酪氨酸蛋白含量检测来评估RNAi和伊马替尼作用效果。结果与伊马替尼一样，RNAi使K562细胞凋亡增强，增生减少，磷酸化的酪氨酸蛋白含量减少。结论RNAi达到伊马替尼杀伤K562细胞的效果，有望在临床用于治疗慢性髓细胞白血病（CML）患者，尤其是那些对伊马替尼等化疗药物不敏感的CML患者。     

全反式维甲酸对HL-60细胞VEGF表达与分泌影响的分子机制研究

目的 探讨人髓系白血病细胞株HL-60在诱导分化过程中血管内皮生长因子(VEGF)表达及分泌水平变化的分子机制.方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HL-60细胞被全反式维甲酸(ATRA)诱导分化后的增殖水平变化,流式细胞术测定HL-60细胞CD11b表达和细胞周期的改变,半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HL-60细胞VEGF、c-myc、缺氧诱导因子(HIF)-1α、基质金属蛋白酶(MMP)-9和MMP-2 mRNA表达水平,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测药物作用前后HL-60细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量.结果 经ATRA诱导分化后,HL-60细胞增殖水平明显降低,CD11b表达水平明显升高,出现粒系定向分化趋势,且分化程度明显升高(P<0.05),c-myc与VEGFmRNA表达水平均明显下调(P<0.05),HIF-1α mRNA表达水平则明显升高(P<0.05).用MMP-2及MMP-9抑制因子Ⅰ阻断HL-60细胞MMP-9和MMP-2表达后,细胞培养上清中VEGF蛋白分泌量明显降低(P<0.05).结论 HL-60细胞被诱导分化过程中VEGF的表达与c-myc表达正相关,与HIF-1α表达负相关.MMP-9、MMP-2可能是调控HL-60细胞分泌VEGF的主要原因之一.     

siRNA干扰对Hela细胞株VEGF表达的影响

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)siRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响。方法:设计合成VEGFsiRNA1、2、3号链,体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株,半定量RT-PCR及Western blot分析转染效果。结果:转染VEGF siRNA1、2号链后,宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达明显下降,但是VEGF蛋白水平下降不明显。结论:VEGF siRNA转染宫颈癌Hela细胞株可下调细胞中VEGFmRNA的表达,不同的siRNA下调mRNA效率不同。作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗宫颈癌一种新方法。