应用基因芯片检测喉鳞状细胞癌甲醛固定石蜡包埋组织microRNA表达谱

目的 建立以甲醛固定石蜡包埋组织为材料、基于基因芯片技术的microRNA(miRNA)表达谱的分析方法 ;筛选与喉鳞状细胞癌(简称喉癌)生物学特征密切相关的差异表达miRNA.方法 从喉癌甲醛固定石蜡包埋组织中制备总RNA,经质量鉴定后进行荧光标记.采用Agilent公司的容纳723条人类miRNA探针的基因芯片完成杂交实验,以获得喉癌的miRNA表达谱.以GeneSpring GX和R-Project软件处理分析基因芯片实验数据,筛选与喉癌转移相关的差异表达miRNA.结果 从24例甲醛固定石蜡包埋组织标本中获得了符合基因芯片实验质量标准的RNA样品,并完成了基因芯片杂交及数据分析.从中共鉴定到319个miRNA,有96个miRNA在24例喉癌中均有表达,其中与淋巴结转移密切相关的(检错率<0.05)差异表达miRNA有5个,分别为miR-23a* 、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425.结论 甲醛固定石蜡包埋组织可以提供符合基因芯片分析质量要求的miRNA,是研究miRNA的重要样品资源.从喉癌的miRNA表达谱中筛选出的转移相关差异表达miRNA(miR-23a*、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425)有可能成为评估喉癌转移风险的新型分子标志.     

应用基因芯片检测喉鳞状细胞癌甲醛固定石蜡包埋组织microRNA表达谱

目的 建立以甲醛固定石蜡包埋组织为材料、基于基因芯片技术的microRNA(miRNA)表达谱的分析方法 ;筛选与喉鳞状细胞癌(简称喉癌)生物学特征密切相关的差异表达miRNA.方法 从喉癌甲醛固定石蜡包埋组织中制备总RNA,经质量鉴定后进行荧光标记.采用Agilent公司的容纳723条人类miRNA探针的基因芯片完成杂交实验,以获得喉癌的miRNA表达谱.以GeneSpring GX和R-Project软件处理分析基因芯片实验数据,筛选与喉癌转移相关的差异表达miRNA.结果 从24例甲醛固定石蜡包埋组织标本中获得了符合基因芯片实验质量标准的RNA样品,并完成了基因芯片杂交及数据分析.从中共鉴定到319个miRNA,有96个miRNA在24例喉癌中均有表达,其中与淋巴结转移密切相关的(检错率<0.05)差异表达miRNA有5个,分别为miR-23a* 、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425.结论 甲醛固定石蜡包埋组织可以提供符合基因芯片分析质量要求的miRNA,是研究miRNA的重要样品资源.从喉癌的miRNA表达谱中筛选出的转移相关差异表达miRNA(miR-23a*、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425)有可能成为评估喉癌转移风险的新型分子标志.     

应用基因芯片检测喉鳞状细胞癌甲醛固定石蜡包埋组织microRNA表达谱

目的 建立以甲醛固定石蜡包埋组织为材料、基于基因芯片技术的microRNA(miRNA)表达谱的分析方法 ;筛选与喉鳞状细胞癌(简称喉癌)生物学特征密切相关的差异表达miRNA.方法 从喉癌甲醛固定石蜡包埋组织中制备总RNA,经质量鉴定后进行荧光标记.采用Agilent公司的容纳723条人类miRNA探针的基因芯片完成杂交实验,以获得喉癌的miRNA表达谱.以GeneSpring GX和R-Project软件处理分析基因芯片实验数据,筛选与喉癌转移相关的差异表达miRNA.结果 从24例甲醛固定石蜡包埋组织标本中获得了符合基因芯片实验质量标准的RNA样品,并完成了基因芯片杂交及数据分析.从中共鉴定到319个miRNA,有96个miRNA在24例喉癌中均有表达,其中与淋巴结转移密切相关的(检错率<0.05)差异表达miRNA有5个,分别为miR-23a* 、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425.结论 甲醛固定石蜡包埋组织可以提供符合基因芯片分析质量要求的miRNA,是研究miRNA的重要样品资源.从喉癌的miRNA表达谱中筛选出的转移相关差异表达miRNA(miR-23a*、miR-28-5p、miR-15a、miR-16和miR-425)有可能成为评估喉癌转移风险的新型分子标志.     

miR-18a、miR-17和miR-20在结直肠癌组织中表达增高

目的 MicroRNAs(miRNAs)是一类在转录后调控基因表达的非编码RNA,越来越多的证据显示:一些在肿瘤中异常表达的miRNAs,有做为肿瘤诊断分子标记和判断预后的潜在价值.该研究应用miRNAs芯片技术筛选结直肠癌组织中差异表达的miRNAs,探索与结直肠癌相关的miRNAs.方法 从3对手术切除的结直肠癌和相配对的正常结直肠组织中提取总RNA,miRNA芯片检测miRNA表达情况,然后在90例配对的结直肠癌和正常结直肠组织中,用Real-time RT-PCR(Taqman)对部分差异表达miRNA进行验证.结果 与配对的正常结直肠组织相比,有22个miRNAs在结直肠癌中异常表达,其中miR-18a、miR-17和miR-20经Real-time RT-PCR(Taqman)验证,在结直肠癌组织中表达显著增高(P=0.006,0.023,0.034).结论 miR-18a、miR-17和miR-20可能参与了结直肠癌的发生过程.     

乳腺癌miRNAs表达谱的检测

目的检测人乳腺癌石蜡组织及人乳腺癌细胞株中miRNAs的表达情况,初步筛选人乳腺癌miRNAs表达谱。方法(1)应用组织微阵列平台,采用原位分子杂交技术对91例人乳腺癌和26例癌旁乳腺组织标本42种miRNA进行检测;(2)培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞株HBL-100,分别抽提细胞总RNA,分离小分子RNA,荧光标记后与miRNAs微阵列杂交,通过芯片扫描和数据分析,获得人乳腺癌miRNAs表达谱。结果(1)与癌旁乳腺组织相比,14种miR-NAs在乳腺癌组织中的表达发生了显著变化(P0.05),其中9种表达上调,5种表达下调。(2)利用miRNAs微阵列,筛选获得71种与人乳腺癌相关miRNAs,与正常乳腺上皮细胞相比,34种miRNAs表达上调,37种表达下调。结论筛选出与乳腺癌相关的差异表达miRNAs,为进一步研究其在乳腺癌中的作用奠定基础。     

食管鳞癌组织中miRNAs差异表达谱的筛选及研究

目的 筛选并鉴定在食管鳞癌（ESCC）及癌旁组织中miRNAs的差异表达,为进一步阐明其在ESCC发病机制中的作用奠定基础。方法 选取在邯郸市第一医院行食管癌切除术患者新鲜的鳞癌组织及癌旁正常组织,各3例,抽提总RNA,利用miRNAs芯片筛选其中差异表达的miRNAs,并对miR-106b-3p通过进一步RT-qPCR 技术进行验证。结果 miRNAs芯片从配对组织中共筛检出62个差异表达的miRNAs,其中41个miRNAs表达上调,21个miRNAs表达下调,鳞癌组织与癌旁正常组织中差异表达的miRNAs比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-106b-3p在ESCC组织中的表达高于癌旁组织,差异有统计学意义（P＜0.05）,与芯片结果一致。结论 食管鳞癌组织中miRNAs的差异表达为进一步研究miRNAs在ESCC发病中的作用奠定了基础;miR-106b-3p的高表达可能与ESCC的发生、发展有关。     

利用存储数十年的档案组织蜡块提取RNA进行回顾性研究

现已证明从福尔马林固定和石蜡包埋的陈旧组织中提取DNA和RNA进行分子生物学研究的有效性。从档案组织中提取的DNA和RNA的质量和数量受不同因素的影响:如固定剂、固定时间、保存     

永久性房颤的转录组分析及miRNA调控网络的建立

目的探索永久性房颤(p AF)发病相关的关键miRNAs及其调控的靶基因。方法联合应用表达谱芯片和miRNA芯片分析p AF患者(n=7)和健康成人(n=4)的左房组织,筛选p AF相关差异表达的miRNAs,进行靶基因预测后,与表达谱芯片的筛选结果进行负相关分析后的基因集合进行显著性功能分析(GO-analysis);利用miRNA与靶基因之间的靶向调控关系,构建差异miRNA与交集靶基因的调控网络(miRNA-gene-network),得到网络中起核心调控作用的miRNA和被调控的关键靶基因;采用RT-q PCR方法检验另一组p AF患者(n=5)和健康成人(n=4)的左房组织标本。结果表达谱基因芯片发现610个mRNA有显著性改变(fold change2,P0.05),miRNA-靶基因调节网络发现与p AF显著相关的20个miRNAs和107个靶基因,相关度最高的是miR-144、miR-1284、miR-1827、miR-1、miR-3613-3p和miR-101;其调控的重要靶基因包括CACNB2、EFNB1、PTEN、TAOK1、RUNX1和TPM3等;RT-q PCR验证结果显示这些miRNAs和靶基因密切相关。结论通过表达谱基因芯片与miRNAs芯片联合分析p AF左房组织标本,构建miRNA调控网络,发现p AF重要的miRNA-靶基因调控及功能,结果更加准确。     

采用非标记microRNA芯片筛选早产胎盘差异表达microRNA

目的应用非标记microRNA芯片筛选在早产胎盘组织中差异表达的miRNA,并分析其相关的靶基因。方法收集早产儿16例为病例组,同期健康足月产儿18例为对照组,取胎盘组织。通过非标记miRNA芯片技术构建早产胎盘组织miRNA表达谱,采用荧光实时定量PCR进行验证,并分析差异表达miRNAs的靶基因。结果 miRNA芯片结果显示44种miRNAs在早产胎盘组织和对照组胎盘组织中差异表达,其中下调表达的11种,上调表达的33种,荧光实时定量PCR验证出miR-493-3p显著下调,mi R-4632-5p显著上调,与芯片结果一致。经软件分析,miRNA靶基因有IL16、SH2D2A、CCNG2、PHB、WNT1、CCDC92、GIT1和ST7L等相关靶基因。结论早产胎盘组织中存在差异表达的miRNAs,提示这些差异表达的miRNAs在早产的发生中有重要的调控作用。     

冷冻切片后甲醛固定石蜡包埋组织DNA质量分析

目的分析冷冻切片后再行甲醛固定、石蜡包埋组织的DNA质量,探讨其在分子病理检测中的应用价值。方法收集已行术中快速冷冻病理诊断的肺腺癌14例,分别提取同一病例冷冻切片后剩余组织蜡块及常规包埋组织蜡块DNA,检测DNA浓度及OD260/OD280值,行内参基因PCR扩增以检测DNA完整性,并以ARMS法行EGFR基因突变检测。结果冷冻切片后固定包埋组织提取DNA浓度及OD260/OD280均值,分别为157.33 ng/μL及1.96,均较常规包埋组织低;所有冷冻后包埋组织提取的DNA均具有100 bp及200 bp的PCR产物,但仅部分能扩增出300 bp及400 bp的PCR产物,DNA完整性稍逊于常规固定包埋组织;冷冻后包埋组织与常规包埋组织EGFR基因突变检测结果完全一致。结论组织冷冻后再行甲醛固定及石蜡包埋,会使得组织DNA进一步降解及片段化,但仍适用于ARMS法的分子病理学检测。     

人乳腺癌MCF-7细胞在不同HER-2水平miRNAs表达谱检测

目的：通过对比观察人乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/HER-2中微小RNA( miRNAs)的差异性表达,初步筛选出与HER-2表达相关的miRNAs表达谱。方法培养人乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/HER-2,利用miRNA芯片技术检测两株细胞中miR-NAs的表达。结果利用miRNA微阵列,筛选获得217种与HER-2相关的miRNAs,较正常MCF-7细胞上调的miRNAs有123个,下调的有94个。在差异有显著性的miRNAs中,hsa-miR-141和hsa-miR-1299的靶基因有多种生物学功能。结论获得人乳腺癌MCF-7细胞在不同HER-2水平miRNAs的差异表达谱,为进一步分析HER-2在乳腺癌中的作用奠定基础。     

衰老相关miRNAs的筛选及鉴定

目的以快速老化模型SAM小鼠的海马组织作为研究对象,通过miRNA芯片大规模筛选与衰老相关的miRNAs,为探讨衰老的机制提供线索。方法随机各选取3只4、8和12月龄SAMP8及SAMR1小鼠,提取海马组织RNA进行芯片检测;以snRNA U6作为内参,SYBR Green作为染料,用real-time PCR方法进行验证,对miRNA的表达进行相对定量分析。结果对比miRNA芯片和real-time PCR验证结果,证实芯片结果具有相对较好的重复性和真实度。对3张miRNA芯片结果进行综合分析,在4和8月龄均表现出表达差异的miRNA共7个,在8和12月龄均表现出表达差异的miRNA共8个,4和12月龄均表现出表达差异的miRNA共3个,在3个月龄间均表现出明显表达差异的1个(miR-9*)。结论 miRNAs在SAMP8及SAMR1的差异表达提示其在SAMP8衰老进程中发挥重要作用。     

Ezrin在浆液性卵巢癌中的表达及临床意义

目的通过检测Ezrin在正常卵巢上皮和浆液性卵巢癌组织中的差异表达,探讨其对浆液性卵巢癌发生发展的影响。方法收取浆液性卵巢癌冷冻组织40例,正常卵巢上皮27例,提取总RNA,采用Real-time PCR技术检测Ezrin mRNA在两组样本中的表达差异;选取有完整临床病理资料的浆液性卵巢癌石蜡包埋组织134例,以及27例非卵巢癌病例的卵巢上皮组织,通过免疫组织化学染色检测两组样本中Ezrin蛋白质的表达差异,并应用SPSS 20.0软件分析其与临床病理的相关性。结果 Ezrin mRNA在新鲜卵巢癌组织中的表达显著低于正常卵巢上皮组织(P0.05)。Ezrin蛋白在石蜡包埋卵巢癌组织中也相应降低(P0.05)。Ezrin蛋白质表达水平与年龄、手术满意程度及化疗敏感程度无相关性,与细胞分化、病理分期及大网膜转移显著相关,(P0.05)。Ezrin表达水平高的浆液性卵巢癌病例的无进展生存期(PFS)值和总生存期(OS)值都明显高于表达水平低的病例(P0.05)。但Ezrin并不能作为浆液性卵巢癌的独立预后因素。结论 Ezrin的表达下调与浆液性卵巢癌的发生发展、转移等病理过程相关,其可以作为临床预后的潜在指标。     

滑膜肉瘤融合基因SYT-SSX的检测及意义分析

目的研究逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)在滑膜肉瘤石蜡包埋组织中检测SYT-SSX融合基因的可行性和意义。方法20例滑膜肉瘤标本均用10％福尔马林固定、石蜡包埋。采用RT-PCR检测SYT-SSX融合基因。看家基因PBGD作为内参照。结果所有标本均可检测到PBGDmRNA的表达。18例(90％)检测到融合基因SYT-SSX的表达。SYT-SSX1型占12例(66．7％)，SYT-SSX2型占6例(33．3％)。结论在经福尔马林固定经石蜡包埋组织的滑膜肉瘤用RT-PCR方法检测SYT-SSX融合基因是可行的，有较高的敏感性。融合基因亚型可能为预后提供重要信息。     

从OCT包埋冰冻组织提取组织RNA和检测病毒RNA

目的探讨如何从OCT包埋冰冻组织提取组织RNA和检测病毒RNA。为临床有限标本的保存和利用提供一简便的方法。方法用汉坦病毒感染的小鼠组织标本，经质量浓度25％蔗糖磷酸缓冲液固定OCT包埋，在-20℃冰箱中保存2年后，对冰冻的OCT包埋的感染组织标本进行RNA提取，用凝胶电泳、紫外分光光度计及RT—PCR等方法检测组织总RNA和病毒RNA。结果组织经质量浓度25％蔗糖磷酸缓冲液固定OCT包埋冰冻保存后，从中提取的RNA仍保持较好的完整性，可扩增出较长片段的病毒RNA。结论OCT包埋的冰冻组织标本不影响提取组织RNA并检测病毒RNA。     

胃癌新鲜和石蜡组织及癌前病变组织中miR-106a的表达

目的：比较miR-106a在胃癌新鲜和石蜡组织中的表达,探讨其在胃癌前病变组织中的表达。方法收集人胃癌和对应癌旁组织新鲜样本30对和石蜡样本40对,采用实时荧光定量 PCR技术检测miR-106a在两组样本中的表达。收集人胃癌前病变石蜡样本20例和胃腺癌石蜡样本40例,采用原位杂交技术检测miR-106a在胃癌早期发生阶段中的表达并与胃癌组织相比较。结果新鲜组织中miR-106a的相对表达量为3.25±1.99,石蜡组织中miR-106a的相对表达量为3.18±2.14,两组相比miR-106a表达量差异无统计学意义（P>0.05）,两组样本miR-106a的表达具有显著相关性（rs =0.998,P<0.001）。在胃癌前病变阶段可以检测到miR-106a的表达,阳性率为70%,阳性颗粒位于不典型增生的上皮细胞内,呈深蓝色细颗粒状物;胃癌组织中miR-106a的阳性率为87.5%,阳性表达范围和强度较癌前病变明显扩大和增强。结论胃癌新鲜组织和石蜡组织中miR-106a的表达呈显著正相关,应用石蜡组织检测miR-106a在胃癌前病变中出现的早期表达变化,可以为胃癌的早期诊断提供有价值的信息。     

COPD动态miRNA表达谱的构建及生物信息学分析

目的构建慢性阻塞性肺疾病(COPD)动态大鼠模型不同时期肺组织miRNA表达谱,并对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析,以了解COPD发生发展中miRNAs变化规律及可能涉及相关机制。方法 1)将大鼠随机分为对照组、吸烟2、4、6、8周组和15周+气管内滴注猪胰弹性蛋白酶组,每组5只,病理学观察其形态学改变;2)取对照组、吸烟4周和15周+气管内滴注猪胰弹性蛋白酶组大鼠肺组织各2例,用于miRNA表达谱芯片分析;3)实时荧光定量PCR法验证芯片数据;4)运用生物信息学法对miRNA表达谱进行靶基因预测及聚类分析。结果 1)成功建立COPD动态大鼠模型,该鼠肺组织早期以出现炎性细胞浸润为主,晚期出现肺气肿改变的动态病理变化;2)成功建立miRNAs动态表达谱,熏烟4周组共30个miRNAs异常表达,熏烟15周组共37个miRNAs异常表达;3)实时荧光定量PCR法证实miR-146a、miR-21、miR-206和miR-181a变化趋势与芯片一致;4)生物信息学分析显示异常表达的miRNAs可能与COPD发病机制密切相关。结论 1)成功构建动态COPD大鼠模型及miRNA表达谱。2)通过生物信息学分析异常表达的miRNA可能在COPD发病机制中发挥重要作用。     

筛选并初步分析不同 HER-2水平的人乳腺癌 BT474细胞内miRNAs差异性表达

目的：检测两株人乳腺癌细胞BT474和BT474/siRNA HER-2微小RNA( miRNAs)的表达,初步筛选与HER-2相关差异性表达的miRNAs。方法用干扰RNA技术沉默人乳腺癌细胞株BT474中HER-2基因的表达,利用miRNA芯片技术比较两株细胞BT474和BT474/siRNA HER-2内miRNAs的表达。结果差异倍数>2且P<0．05,与HER-2相关的miRNAs有338个;其中110个miRNAs上调,228个miRNAs下调。结论用miRNA芯片技术可以筛选人乳腺癌BT474细胞在不同HER-2水平差异性表达的miRNAs,进一步分析筛选,有望在乳腺癌中寻找到与HER-2相关的miRNAs。     

胃癌组织中microRNA的差异表达

目的 检测胃癌组织和癌旁组织中microRNA (miRNA)的差异表达.方法 收集经病理确诊为胃癌进行外科手术切除的25例患者的胃癌组织及距离胃癌病灶5 cm以上的癌旁组织,选取其中7例标本提取总RNA,应用Illumina miRNA芯片检测胃癌和癌旁组织中差异表达的miRNA.应用定量实时PCR技术验证25例胃癌和癌旁组织标本中差异表达的miRNA,并分析25例患者的临床病理与胃癌组织中miRNA差异表达的关联.结果 Illumina miRNA芯片检测显示,HS-138,HS-153,HS-157在胃癌组织中表达下调,miR-181a,miR-21,miR-21*,miR-27a,miR-584,miR-93在胃癌组织中表达上调.定量实时PCR显示,与癌旁组织比较,胃癌组织中miR-181a表达上调(56.848±135.551比3.950±12.101,P＜0.05),而miR-584在胃癌和癌旁组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05).胃癌组织miR-181a表达与患者胃癌淋巴结转移及年龄有关联(rp=0.462、0.414,P=0.009、0.023),与性别和病理分型无关联(P=0.220、0.106).结论 应用miRNA芯片技术和荧光定量PCR技术发现了胃癌组织中差异表达的miRNA.     

探讨两种石蜡包埋组织DNA提取方法

正随着精准医学和个体化医学的快速发展,人们对分子检测的研究越来越广泛、越来越深入;寻找疾病的遗传学发病因素,对不同患者实施适于其病情的治疗及使用不同剂量的药物逐渐成为医学发展的方向[1,2]。新鲜组织、石蜡包埋组织、外周血、胸腹水等样本中核酸的提取,是分子生物学的基本要求。由于患者病程及身体状况等原因,很多情况下短期内获取人体新鲜组织、胸腹水等标本较困难,而甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embeded tissue,FFPET)