2型登革病毒诱导RAW264.7细胞凋亡的机制及凋亡对病毒复制的影响

 目的：探讨2型登革病毒（DENV2）感染能否诱导RAW264.7细胞凋亡,并初步探讨凋亡对病毒复制的影响。方法：用DENV2感染RAW264.7细胞,MTT检测细胞活性,Hoechst 33342染色检测细胞核变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测caspase-3和caspase-8活化片段的变化,比色法检测caspase-9活性变化,JC-1染色检测线粒体膜电位变化,Z-VAD-FMK抑制细胞凋亡后以TCID50检测感染细胞上清病毒滴度。结果：DENV2感染RAW264.7细胞24 h、36 h及48 h后细胞活性受到抑制,免疫荧光检测有核固缩现象,流式细胞术检测发现病毒感染诱导了细胞凋亡,Western blotting检测发现活化caspase-3和caspase-8的表达增加,caspase-9活性也增加,JC-1染色发现病毒感染诱导RAW264.7细胞线粒体膜电位降低,用Z-VAD-FMK抑制凋亡后感染细胞上清病毒滴度增加。结论：登革病毒感染可以通过内、外源性途径诱导RAW264.7细胞发生凋亡;凋亡发生抑制了病毒的产生。     

干扰NaV1.9对RAW264.7细胞增殖、吞噬和迁移的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默RAW264.7小鼠巨噬细胞中电压门控性钠通道(VGSCs/NaVs)α亚单位NaV1.9基因,建立稳定干扰细胞株,并观察其对细胞增殖活性、吞噬能力和迁移功能的影响.方法 通过LipofectamineTM2000将短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选获得稳定细胞株.用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定干扰效率,CCK-8法测定稳定细胞株的增殖活性,流式细胞术检测细胞的细胞周期及吞噬能力,Transwell小室法检测细胞的迁移功能.结果 成功建立稳定干扰NaV1.9的细胞株,RT-PCR法鉴定干扰效率达80％.CCK-8法及流式细胞术结果显示,降低NaV1.9的表达使细胞增殖活性下降(P＜0.05);流式细胞术结果显示,抑制NaV1.9的表达使细胞吞噬能力降低(P＜0.05);Transwell小室法结果显示,干扰NaV1.9的表达使细胞迁移能力减弱(P＜0.05).结论 建立了稳定干扰NaV1.9的RAW264.7细胞株,下调NaV1.9的表达使巨噬细胞增殖活性、吞噬能力和迁移功能显著降低.     

胶球藻多糖对RAW264.7细胞凋亡的影响

目的探讨胶球藻多糖对RAW264.7细胞凋亡的影响及其可能机制。方法培养RAW264.7细胞,分为对照组、胶球藻多糖(2mg/ml)组及胶球藻多糖(4mg/ml)组;利用流式细胞仪检测各实验组中细胞的凋亡率;采用Western blot检测各实验组中凋亡相关因子Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xl及Caspase-3蛋白的表达。结果相较于对照组,胶球藻多糖处理组不仅可以诱导RAW264.7细胞发生凋亡,增加促凋亡蛋白(Bad,Bax)的表达及减少抗凋亡蛋白(Bcl-2, Bcl-xl)的表达,而且还能上调剪切型Caspase-3蛋白的水平,且均呈剂量依赖性。结论胶球藻多糖显著促进RAW264.7细胞发生凋亡,其机制可能与Bad、Bax表达上调,Bcl-2、Bcl-xl表达下调及Caspase-3的激活有关。     

干扰盐皮质激素受体基因对RAW 264.7细胞增殖和凋亡的影响

 目的：应用RNA干扰技术沉默小鼠RAW 264.7巨噬细胞盐皮质激素受体(MR)基因,建立稳定干扰细胞株,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法：针对MR基因设计合成重组MR shRNA质粒,脂质体法转染质粒至RAW 264.7细胞,经G418筛选后获得稳定表达细胞株。细胞分为3组：野生型(WT)组、阴性对照（NC）组和干扰（shMR）组。荧光显微镜下观察确定细胞的转染效率;实时定量PCR法检测细胞中MR mRNA的表达;CCK-8方法检测细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡情况。结果：(1) MR shRNA能明显抑制RAW 264.7细胞的MR基因表达,抑制率70%以上。(2) 从第3 d开始,shMR组细胞的生长速度明显低于NC和WT组（P<0.05）,说明MR shRNA能明显抑制细胞增殖。(3) WT、NC和shMR组的增殖指数分别为(37.2±0.5)%、(37.5±1.6)%和(31.0±1.3)%,shMR组的细胞周期出现改变,S期和G₂/M期比例明显下降,增殖指数下降（P<0.05）。(4) WT、NC和shMR组的细胞凋亡率分别为(2.18±0.36)%、(6.65±0.81)%和(7.70±1.34)%,shMR组略高于NC组,但二者的差异无统计学意义（P>0.05）。结论：本研究成功构建了稳定干扰MR基因表达的RAW 264.7细胞株,MR shRNA能够明显抑制RAW 264.7细胞增殖,但对其凋亡无明显影响。     

M-CSF对RAW264.7细胞抗氧化系统的影响

目的：探讨巨噬细胞集落刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ,Ｍ－ＣＳＦ）抗单核／巨噬细胞氧化损伤的作用机理,揭示Ｍ－ＣＳＦ对小鼠巨噬细胞系ＲＡＷ２６４．７细胞抗氧化系统影响。方法：以Ｌ９２９细胞条件培养液为Ｍ－ＣＳＦ来源,采用酶活笥测定等生化测定方法,考察Ｍ－ＣＳＦ细胞内还原型谷胱甘肽含量、脂质过氧化物含量、过氧化氢酶活性、谷胱甘肽还原酶活性等检测指标     

姜黄素对LPS刺激RAW264.7细胞PGE_2和IL-10影响

目的:观察姜黄素对脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞炎症因子的影响。方法:体外培养小鼠RAW264.7细胞,脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞分泌细胞因子,用不同浓度姜黄素进行干预,ELISA法检测培养上清液中抗炎细胞因子IL-10和炎症因子PGE2含量。结果:姜黄素可抑制脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞释放PGE2,促进抗炎因子IL-10表达,并呈一定量效关系,其影响细胞因子释放作用与细胞毒作用无关。结论:姜黄素呈浓度依赖性地抑制脂多糖刺激小鼠RAW264.7细胞释放PGE2,促进IL-10表达。     

雪胆素甲通过破坏微丝结构诱导LPS活化的RAW264.7细胞凋亡

目的分析雪胆素甲(CuIIa)对脂多糖(LPS)活化的RAW264.7巨噬细胞的影响,探讨其潜在的抗炎效应及作用机制。方法MTS法检测CuIIa对RAW264.7细胞增殖的作用,相差显微镜观察CuIIa对LPS活化的细胞形态的影响,荧光显微镜观察CuIIa对细胞骨架的影响,流式细胞仪检测亚二倍体(凋亡)峰的变化,免疫印迹检测Cleaved caspase-3、生存素以及G-actin与F-actin的变化。结果 CuIIa能明显抑制RAW264.7细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性,但单独CuIIa不能有效诱导细胞凋亡。CuIIa使LPS活化的伸展细胞收缩变圆,伪足突起消失,G-actin水平下降,细胞内发生严重的Actin聚集,说明微丝结构被破坏。随着CuIIa浓度的增加,其诱导LPS活化的RAW264.7细胞处于sub-G0/G1(凋亡峰)的数量明显增加。免疫印迹分析显示CuIIa使Caspase-3明显活化,生存素急剧下降。结论 CuIIa可能通过引起Actin聚集而破坏微丝细胞骨架,诱导LPS活化的RAW264.7细胞发生凋亡,从而发挥其抗炎效应。     

肺炎链球菌溶血素经死亡受体/Fas途径和线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡

目的:探讨肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,Ply)对小鼠RAW264.7细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及机制。方法:Ply蛋白加入RAW264.7细胞培养上清与细胞共孵育。倒置显微镜观察Ply对RAW264.7细胞形态的影响。MTT法检测Ply对RAW264.7细胞的增殖抑制。Annexin V法检测细胞凋亡率。分光光度法检测Caspase-3、8、9活性。免疫细胞化学法检测到Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达。结果:Ply对小鼠RAW264.7细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞24小时后,可见典型的凋亡形态学改变;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞1小时和3小时后,细胞凋亡率分别为32.90%和51.56%(P<0.05);1μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞24小时,Caspase-3、8、9活性均比对照组升高(P<0.05);免疫细胞化学法检测到Bax、Fas表达较对照组增强,Bcl-2表达减弱(P<0.01)。结论:Ply可诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡,诱导凋亡的机制可能是通过死亡受体/Fas途径和线粒体途径双重机制的介导实现。     

过表达TGF-β1可抑制人宫颈癌细胞系C-33A增殖和促进凋亡

目的研究TGF-β1基因转染对人宫颈癌细胞系(C-33A)增殖和凋亡的影响。方法取增殖状态良好的宫颈癌细胞C-33A,用基因转染的方法建立TGF-β1过表达质粒,用RT-PCR和Western blot法分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达及其Bcl-2和Bax的表达;用MTT实验、Transwell小室迁移实验和流式细胞术分别检测细胞的增殖率、迁移率及凋亡率。结果 TGF-β1 mRNA和蛋白在宫颈癌C-33A细胞中的表达低于其他细胞(P0. 05); TGF-β1抑制Bcl-2的表达(P0. 05)、促进Bax的表达(P0. 05);过表达TGF-β1细胞的增殖与迁移速度低于其他细胞(P0. 05),但凋亡速度高于其他细胞(P0. 05),且这种降低与升高均呈时间依赖性。结论过表达的TGF-β1可明显抑制宫颈癌细胞的增殖和促进凋亡。     

TGF-β1诱导HL-60细胞株凋亡作用的研究

为探讨转化生长因了β     

葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响

背景：葛根素是葛根中含有的一种黄酮类衍生物,其可以预防骨质疏松、促进新骨生成,有望成为治疗骨质破坏相关疾病的潜在药物。目的：观察葛根素对RAW264.7细胞破骨分化能力的影响,探究Notch信号通路在其中的调控作用。方法：将RAW264.7细胞分5组干预培养：对照组加入DMEM高糖培养基;破骨诱导组加入破骨诱导培养基(含巨噬细胞集落刺激因子与核因子κB受体活化因子配体的DMEM高糖培养基);低、中、高浓度葛根素组分别加入含10,25,50μmol/L葛根素的骨诱导培养基。培养7 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色及F-actin染色评估破骨细胞形成情况,RT-PCR检测破骨细胞形成相关基因的表达,Western blot及RT-PCR检测Notch信号通路相关指标表达。结果与结论：(1)抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,与对照组比较,破骨诱导组破骨细胞形成能力升高(P <0.01);与破骨诱导组比较,低、中、高剂量葛根素组破骨细胞形成能力降低(P <0.05,P <0.01),且呈浓度依赖性;(2)F-actin染色显示,与对照组比较,破骨诱导组出现边界清晰的F-actin环...     

Krüppel样因子4基因干扰对RAW264.7细胞凋亡和吞噬的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默小鼠RAW264.7巨噬细胞Krüppel样因子4(KLF4)基因,建立稳定干扰细胞株,观察其对细胞增殖、凋亡和吞噬活性的影响.方法 针对小鼠KLF4基因设计合成重组KLF4 shRNA质粒,脂质体法将重组质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选后获得稳定表达细胞株.Western blot法检测细胞中KLF4蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞的凋亡情况;荧光素标记的大肠杆菌结合流式细胞仪检测细胞的吞噬活性.结果 KLF4 shRNA能明显抑制RAW264.7细胞的KLF4蛋白的表达,抑制率76％以上;从第3天开始,shKLF4组细胞的生长速度明显低于NC组(转染阴性质粒pGPU6/GFP/Neo-NC)(P ＜0.05);WT组(野生型RAW264.7)、NC组和shKLF4组的细胞凋亡率分别为:1.73％、6.85％和12.76％,shKLF4组明显高于NC组(P＜0.05);各组细胞的平均荧光强度分别为:WT组(122.0±2.80)、NC组(48.97±5.69)和shKLF4组(80.10 +4.61),与NC组相比,shKLF4组的细胞吞噬活性明显增高(P＜0.05).结论 成功构建了稳定干扰KLF4基因表达的RAW264.7巨噬细胞株,KLF4下调能够明显抑制RAW264.7细胞增殖,促进细胞凋亡,增强细胞的吞噬活性.     

羟基化多壁碳纳米管对RAW264.7细胞增殖及功能影响研究

目的研究羟基化多壁碳纳米管对巨噬细胞RAW264.7的活性、吞噬功能及氧化应激的影响。方法将质量浓度分别为1、10、100、200μg/mL的羟基化多壁碳纳米管与原始多壁碳纳米管分别与小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞共育24、48、72 h,采用CellTiter-GloR发光法进行细胞活性测定,用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐法(DCFH-DA)检测细胞内活性氧自由基(ROS)的生成。选24只小鼠,雌雄不限,鼠龄5～6周,体质量18～25 g,随机分为4组,同时通过鸡红细胞吞噬实验检测细胞吞噬能力的变化。结果CellTiter-GloR发光法检测显示碳纳米管的细胞毒性作用呈现浓度依赖性,只有在质量浓度为10μg/mL时,羟基化多壁碳纳米管比原始碳纳米管细胞毒性小,其他浓度两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。鸡红细胞吞噬实验证实两种碳纳米管具有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用。结果还显示,在碳纳米管质量浓度为1μg/mL和10μg/mL时,羟基化多壁碳纳米管诱导细胞内ROS含量升高程度高于原始多壁碳纳米管,而在高浓度组(100μg/mL和200μg/mL),随着孵育时间延长,原始多壁碳纳米管诱导细胞内ROS含量不断增加,明显高于羟基化多壁碳纳米管对细胞的作用。结论两种碳纳米管可显著抑制巨噬细胞增殖并提高细胞吞噬活性;不同浓度的多壁碳纳米管与细胞相互作用时,羟基化多壁碳纳米管与原始多壁碳纳米管诱导细胞内ROS升高机制不同。     

羟基磷灰石形貌对RAW264.7细胞破骨分化影响研究

目的　分析羟基磷灰石（HAp）不同形貌对小鼠单核RAW264.7细胞破骨分化性能的影响。  方法　采用水热合成及pH调节的方法获得不同形貌羟基磷灰石微米颗粒,通过扫描电子显微镜（SEM）表征材料形貌。将不同形貌HAp与RAW264.7细胞共培养,通过Live/Dead活性染色检测HAp对细胞活性有无影响;并在RANKL破骨诱导因子的作用下通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、实时荧光定量(qRT-PCR)分析不同形貌HAp对RAW264.7细胞破骨分化的影响。  结果　24h Live/Dead活性染色证实微棒与微球HAp均具有良好的生物相容性。qRT-PCR结果表明,两种形貌HAp均抑制RAW264.7细胞的破骨分化,而相对于微球HAp,微棒HAp抑制作用较显著。  结论　羟基磷灰石形貌的差异能够引起RAW264.7破骨分化性能的差异表达。     

含M-CSF条件培养液对RAW264.7细胞产生NO的影响

巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF )是一种单核吞噬细胞特异性的生长因子。近年来的研究表明 ,M CSF可以增强巨噬细胞杀伤细菌等病原体及肿瘤细胞的能力 ,对抗感染及抗肿瘤具有重要意义。一氧化氮 (NO )是可由单核吞噬细胞产生的一种自由基 ,对病原体及肿瘤细胞同样具有杀伤作用。为探讨M CSF的抗感染、肿瘤作用是否与其刺激单核吞噬细胞产生NO有关 ,我们以L92 9细胞条件培养液 (L92 9 CM )作为M CSF来源 ,观察了M CSF对巨噬细胞系RAW2 64 7细胞NO产生的影响。结果发现 ,L92 9 CM可以刺激RAW2 64 7细胞NO的产生 ;且RT PCR显示L92 9 CM处理使RAW2 64 7细胞诱导型NO合酶 (iNOS )表达增加。     

TGF-β1诱导HL-60细胞株凋亡作用的研究

为探讨转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）在体外诱导早幼粒细胞白血病细胞株（ＨＬ－６０）凋亡的作用及其相关的细胞和分子机制,本实验以ＴＧＦ－β１在体外对ＨＬ－６０细胞株作用,通过电镜,ＴＵＮＥＬ法,流式细胞仪,免疫细胞化学实验方法中的实验方法,观察ＴＧＦ－β１对ＨＬ－６０细胞株凋亡的诱导作用,以及相关基因的表达变化。     

激活素A对RAW264.7巨噬细胞活性的调节作用

目的探讨激活素A对参与炎症反应的小鼠巨噬细胞活性调节作用。方法以LPS刺激活化的小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞作为阳性参照,ELISA法检测激活素A及LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264．7细胞IL-1β分泌水平,还原酶法分析NO分泌水平,RT-PCR检测IL-1β和iNOS mRNA的表达,瑞氏染色检测RAW264．7细胞吞噬活性。结果在激活素A刺激下RAW264．7细胞IL-1β和NO分泌水平均明显升高,IL-1β和iNOS mRNA表达亦增加,巨噬细胞吞噬活性增强;激活素A和LPS共刺激RAW264．7细胞时,激活素A明显抑制LPS刺激的RAW264．7细胞IL-1β和NO产生水平,以及IL-1β和iNOS mRNA表达,巨噬细胞吞噬活性也明显低于LPS单独刺激组。结论激活素对巨噬细胞的活性调节具有双重作用,这种作用与巨噬细胞的激活状态有关。     

M-CSF对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用

揭示巨噬细胞集落刺激因子是否能保护单核巨噬细胞免受过氧化损伤。方法以Ｌ９２９细胞条件培养液作为Ｍ－ＣＳＦ来源,以细胞显微形态,细胞活力等指标,观察了Ｍ－ＣＳＦ对叔丁基氢化物诱导的巨噬细胞系ＲＡＷ２６４．７细胞氧化损伤的影响。结论Ｍ－ＣＳＦ对单核巨噬细胞的氧化损伤具有保护作用。     

MicroRNAs途径在RAW264.7细胞中作用的初步研究

目的通过检测microRNAs生成的关键酶Dicer在RAW264.7细胞不同功能状态下的表达差异研究microRNAs途径在其中产生的作用。方法采用QRT-PCR、流式细胞术等对RAW264.7细胞在不同功能分化状态下的Dicer酶进行检测。结果GMCSF与MCSF分别刺激RAW264.7细胞诱导其增殖分化后,Dicer酶的mRNA水平显著增高,但随刺激时间呈现不同趋势(P<0.01);在诱导凋亡死亡状态下,RAW264.7中Dicer酶的表达下降30%(P<0.01);LPS与IL-4分别诱导RAW264.7细胞分化为M1和M2型,Dicer的表达与M1、M2型相关炎性因子的表达有相关性。结论 MicroRNAs调控途径参与并影响RAW264.7不同功能状态。     

ox-LDL/β2GPI/aβ2GPI复合物促进小鼠RAW264.7细胞凋亡和炎症因子表达

目的 探讨氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I抗体(ox-LDL/β2GPI/aβ2GPI)复合物对小鼠RAW264.7细胞凋亡和炎症因子表达的影响及机制.方法 分别用培养基、ox-LDL、β2GPI/抗β2GPI抗体复合物、ox-LDL/β2GPI复合物、ox-LDL/抗β2GPI抗体复合物和ox-LDL...