siRNA沉默COX-2基因对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的 利用小分子RNA(small interfering RNA,siRNA)技术体外沉默人胶质瘤细胞COX-2基因表达,探讨其对放射敏感性的影响,以期为胶质瘤的治疗提供新的思路和方法。 方法 体外培养胶质瘤U251细胞,使用siRNA技术构建U251细胞COX-2基因沉默模型,Western blot检测转染后细胞COX-2蛋白表达情况,筛出最适序列。将实验分为对照组与转染组,分别予以2、4、6、8 Gy四个剂量组予以X线照射,实验重复3次,使用MTT法检测辐射后细胞增殖抑制情况,平板克隆形成实验检测细胞存活分数(SF)并通过单击多靶拟合曲线计算增敏比(SER),流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果 转染组COX-2蛋白表达情况较对照组均下降,其中以siRNA600序列降低最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05),后续实验均以siRNA600序列进行转染。辐射后转染组的细胞增殖抑制率为(84.87±3.50)%、(63.62±0.35)%、(55.05±4.87)%、(36.85±3.00)%,较对照组增殖抑制作用明显增强,并随放射剂量增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。辐射后的转染组SF低于对照组,且转染组D0为4.110,Dq为1.387,均低于对照组,对照组D0为6.908,Dq为2.772,放射增敏比SER为1.680,差异有统计学意义(P<0.05)。辐射后的转染组细胞凋亡率为(3.63±0.45)%、(6.08±0.87)%、(47.97±2.13)%、(59.56±3.07)%均高于对照组,且在6 Gy、8 Gy照射后升高更为明显。 结论 siRNA技术沉默人胶质瘤U251细胞COX-2基因表达可以提高细胞的放射敏感性,增加了放射后细胞的凋亡率及增殖抑制作用,降低了克隆形成率。      

siRNA沉默FANCD2基因增加肺癌A549/DDP细胞对顺铂化疗的敏感性

目的: 研究siRNA沉默FANCD2基因后人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株对顺铂(DDP)耐药性的变化。方法:合成针对FANCD2基因的siRNA(FANCD2 siRNA),采用脂质体将其分别转染肺癌A549细胞株和A549/DDP耐药细胞株。CCK-8法测定经DDP处理的A549和A549/DDP细胞株转染siRNA前后的细胞增殖率变化;免疫印迹法测定2种细胞株转染siRNA前后FANCD2蛋白单泛素化水平;免疫荧光测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成。结果：经DDP处理的A549/DDP细胞增殖率,FANCD2蛋白单泛素化水平及核聚小体形成程度明显高于A549细胞。转染FANCD2-siRNA后,A549和A549/DDP细胞的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成明显降低,细胞增殖率显著下降。结论： 应用siRNA转染技术沉默FANCD2基因可抑制FA/BRCA途径的DNA修复功能,从而增加肺癌细胞对DDP的敏感性,部分逆转耐药肺癌细胞株对DDP的耐药性。     

沉默Ambra1基因增强大肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性

目的:观察5-FU对沉默Ambra1基因的大肠癌细胞的化疗敏感性影响。方法:将靶向Ambra1基因的si RNA转染至大肠癌细胞HCT15和HCT116,用Real-time PCR和Western blotting方法检测Ambra1 mRNA和蛋白的表达;采用MTS方法检测HCT15和HCT116细胞的活力。结果:HCT15、HCT116细胞转染siRNA-Ambra1-1、siRNA-Ambra1-2后的Ambra1 mRNA表达水平均分别低于siRNAAmbra1-HCT15-NC、siRNA-Ambra1-HCT116-NC细胞(P0.05);HCT15、HCT116细胞转染后的蛋白表达均低于阴性对照;4μg/mL时,HCT15和HCT116细胞转染si RNA-Ambra1-1、siRNA-Ambra1-2后的细胞克隆形成数均少于0μg/m L(P0.05),而且HCT15、HCT116细胞转染si RNA-Ambra1-1、siRNAAmbra1-2后的细胞克隆形成数均分别少于si RNA-Ambra1-HCT15-NC、si RNA-Ambra1-HCT116-NC(P0.05);HCT15、HCT116细胞转染si RNA-Ambra1-1、siRNA-Ambra1-2后的细胞生存率均分别低于siRNA-Ambra1-HCT15-NC、siRNA-Ambra1-HCT116-NC(P0.05);且随着药物浓度增加,已转染了siRNA-Ambra1的细胞生存率均低于阴性对照组。结论:沉默Ambral基因可提高大肠癌细胞对5-FU的化疗敏感性。     

TPX2基因沉默对膀胱癌耐药细胞株T24/DDP顺铂化疗敏感性的增强作用及其机制

目的：探讨爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)基因沉默对膀胱癌耐药细胞株T24/顺铂(DDP)的化疗敏感性的影响,并阐明其作用机制。方法：采用DDP浓度梯度刺激法建立DDP耐药细胞株T24/DDP,将细胞分为T24细胞组和T24/DDP细胞组。MTT法检测各组细胞增殖活性,并根据半数抑制浓度(IC₅₀)值计算耐药指数(RI);实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法和Western blotting法检测细胞中TPX2 mRNA及蛋白表达水平。通过小干扰RNA (siRNA)沉默T24/DDP细胞中TPX2基因表达,再将细胞分为空白对照组、阴性对照干扰(si-NC)组、TPX2沉默(si-TPX2)组、 si-NC+DDP (2mg·L^-1DDP)组和si-TPX2+DDP (2mg·L^-1DDP)组。RT-qPCR法和Western blotting法检测转染后细胞中TPX2 mRNA及蛋白表达水平,MTT法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组凋亡细胞率和细胞周期G2/M期百分率,Transwell小室实验...     

沉默热休克蛋白27基因增强大肠癌细胞对5-FU化疗敏感性

目的:探讨不同大肠癌细胞热休克蛋白(HSP27)蛋白表达水平及其与5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的关系,同时通过RNA干扰抑制HSP27基因的表达,初步探讨沉默该基因对5-FU抗肿瘤作用的影响。方法:Western blot法检测各大肠癌细胞中HSP27蛋白的表达水平,CCK-8法测定不同浓度5-FU对各细胞株的抑制率,分析各组细胞HSP27蛋白表达水平与IC50的关系。设计合成3对针对不同靶点的HSP27小干扰RNA,通过脂质体转染SW480细胞,激光共聚焦显微镜观察转染效率,Real-time PCR及Western blot法检测转染后HSP27 m RNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测HSP27-si RNA对细胞的生长抑制作用及沉默HSP27基因细胞对5-FU化疗敏感性的变化。结果:各组细胞中HSP27的表达水平与5-FU的敏感性呈负相关性。Real-time PCR及Western blot法结果显示有两对靶向HSP27-si RNA能有效抑制HSP27 m RNA及蛋白水平的表达;CCK-8法检测结果显示HSP27-si RNA转染可增强SW480细胞对5-FU的敏感性,半数抑制浓度(IC50)明显下调。HSP27在大肠癌细胞中的表达水平与5-FU化疗药IC50值呈正相关。结论:靶向HSP27的si RNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达,增强5-FU化疗药物的敏感性。     

塞来昔布增强口腔癌化疗敏感性与阻滞周期进程的相关性

目的探讨塞来昔布增强口腔癌细胞化疗敏感性与其阻滞细胞周期进程及调节P-gp之间的相关性。方法塞来昔布10、
20、40、80 μmol/L和/或长春新碱0.375、0.75、1.5、3 μmol/L处理KB/VCR细胞后,分别采用MTT法检测KB/VCR细胞生长抑制
率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测周期相关蛋白Cyclin D1、p21WAF1/CIP1及P-gp的蛋白表达。结果塞来昔
布浓度较低时（<20 μmol/L）对KB/VCR生长增殖无明显影响,但小剂量的塞来昔布10 μmol/L可显著增强VCR对KB/VCR细
胞的毒性作用,并呈时间依赖性。塞来昔布与长春新碱联合作用于KB/VCR细胞24、48、72 h后,其生长抑制率分别为（37.53±
2.05）%、（46.67±3.17）%及（54.02±1.53）%,显著高于塞来昔布和长春新碱单独用药组（P均<0.01）。塞来昔布与VCR联合应用
能改变细胞周期分布,与VCR组相比,联合用药组G0/G1期细胞数量增加（56.08±0.46）%,S期和G2/M期细胞数目降低［S期：
（22.83±0.20）%;G2/M期：（21.09±0.66）%］。此外,与VCR组细胞相比,联合用药能显著降低Cyclin D1的表达,增强p21WAF1/CIP1
的表达,并且Cyclin D1蛋白水平的降低及p21WAF1/CIP1蛋白水平的上升伴随着P-gp蛋白的下调。结论塞来昔布下调节P-gp而增
强KB/VCR细胞对化疗药物的敏感性可能与Cyclin D1和p21WAF1/CIP1蛋白变化引起的细胞周期阻滞有关。
     

siRNA沉默己糖激酶-2基因对MDA-MB231细胞放疗敏感性的影响

目的 观察小干扰RNA(siRNA)沉默己糖激酶-2(HK2)对乳腺癌细胞MDA-MB231放疗敏感性的影响.方法 实验分为3组:空白(Control)组、阴性对照(Negative)组和转染HK2 siRNA的实验(siRNA-HK2)组.将HK2 siRNA瞬时转染于MDA-MB231细胞,用Western blot和qRT-PCR分别检测转染前后HK2蛋白和mRNA表达;CCK-8实验观察不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X线照射下三组细胞增殖情况;流式细胞仪检测三组细胞在4 Gy照射下细胞凋亡率,观察siRNA干扰HK2对乳腺癌细胞MDA-MB231放疗敏感性的影响.结果 siRNA-HK2组HK2的蛋白和mRNA表达量均降低.三组细胞分别给予不同剂量的X线照射后,细胞存活率呈剂量依赖性递减的趋势,且siRNA-HK2组的存活率较Control组和Negative组明显下降(P<0.05).照射后,siRNA-HK2组细胞凋亡率明显高于Control组和Negative组(P<0.01).结论 沉默乳腺癌细胞HK2基因可增加其对放疗的敏感性.     

沉默SOCS1基因表达对人口腔癌KB细胞增殖的机制研究

目的:探究小干扰RNA(siRNA)沉默细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)基因对人口腔癌KB细胞增殖、凋亡及侵袭的影响,旨在为口腔癌患者基因靶向治疗提供参考。方法:将培养好的人口腔癌KB细胞随机分为空白对照组、阴性组、转染组,siRNA沉默SOCSl基因、阴性对照质粒分别转染至转染组、阴性组,而空白对照组不作任何处理,SOCS1基因沉默后,四唑盐法检测三组KB细胞增殖率、流式细胞术检测各组KB细胞凋亡率,同时检测三组细胞侵袭能力。结果:siRNA沉默SOCS1基因在人口腔癌KB细胞中呈阳性表达(细胞膜或细胞质呈棕黄色),转染组基因沉默后24、48、72、96 h人口腔癌KB细胞增殖率明显低于阴性组,比较差异有统计学意义(P<0.05);转染组人口腔癌KB细胞凋亡率高于空白对照组和阴性组,空白对照组人口腔癌KB细胞凋亡率高于阴性组,比较差异有统计学意义(P<0.05);转染组穿膜细胞数低于空白对照组和阴性组,阴性组穿膜细胞数低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:siRNA沉默SOCS1基因可减弱人口腔癌KB细胞的增殖能力,并抑制其侵袭能力,有望为...     

Bcl-2 siRNA增强HepG2细胞对5-氟尿嘧啶敏感性

目的 观察Bcl-2 siRNA对人类肝癌细胞HepG2 5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的影响。方法 Bcl-2 siRNA表达载体构建并稳定转染至肝癌细胞HepG2中,用G418筛选稳定的阳性细胞克隆。用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA水平,免疫荧光检测目的基因Bcl-2蛋白水平的表达。用131、30、1300和13 000 mg/L 5-FU处理稳定转染细胞,用MTT观察细胞对药物敏感性的影响,用流式细胞术观察细胞凋亡情况。Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白水平。结果 5-FU处理细胞24 h,Bcl-2 siRNA转染组的细胞生长抑制率明显高于阴性载体转染组和正常细胞;Bcl-2 siRNA转染组细胞凋亡率高于正常细胞和阴性载体转染组;在Bcl-2表达下调时,Bax蛋白表达水平不变。结论 siRNA下调目的基因Bcl-2能增强人类肝癌细胞HepG2对5-FU的敏感性;HepG2细胞对5-FU的敏感性增强与Bax/Bcl-2的比例增高有关。     

Hiwi基因靶向沉默对乳腺癌MCF-7/ADM细胞化疗敏感性的影响

目的：探讨耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADM细胞应用Hiwi基因靶向沉默技术后对阿霉素敏感性的变化,阐明Hiwi基因在乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药机制中的作用。方法：MCF-7/ADM细胞分为对照组、Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组,分别转染Hiwi control、Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2 3种不同载体,应用实时定量PCR和Western blotting法检测Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平,判断转染效率。转染后各组乳腺癌MCF-7/ADM细胞加入不同浓度阿霉素（0、0.1、0.5和1.0mg·L^-1）,0mg·L^-1阿霉素组为对照组,采用MTT法检测各组MCF-7/ADM细胞的存活率,即耐药敏感性。结果：与对照组比较,转染后Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2组细胞中Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。与对照组比较,经不同浓度阿霉素作用后,Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组细胞存活率明显降低（P<0.01）,阿霉素浓度为1.0 mg·L^-1时,2组细胞存活率分别为（48.15±6.28）%和（41.73±6.17）%,对阿霉素的敏感性明显增强。结论：Hiwi基因在MCF-7/ADM细胞中具有高效的靶向沉默,Hiwi基因沉默后的MCF-7/ADM细胞对阿霉素恢复敏感性。     

siRNA沉默葡萄糖调节蛋白78可增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的探讨siRNA沉默葡萄糖调节蛋白78（GRP78）增强顺铂对乳腺癌细胞凋亡的敏感性,以期为乳腺癌的临床治疗提供
新的靶点。方法MTT法检测不同浓度（0、1、2、4、8、16 μmol/L）顺铂对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用;PI/Annexin
V 双染检测顺铂（8 μmol/L）对siRNA转染沉默GRP78乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响,同时将未转染和转染空质粒乳腺
癌细胞MDA-MB-231 作为空白和阴性对照;Western blot 检测顺铂（8 μmol/L）处理乳腺癌细胞MDA-MB-231 不同时间（0、6、
16、24 h）GRP78的表达以及siRNA转染沉默GRP78乳腺癌细胞MDA-MB-231 中GRP78的表达。结果8 μmol/L顺铂作用于
乳腺癌细胞MDA-MB-231 24、48、72 h细胞存活率分别为83.13%、54.22%、35.79%,但24 h细胞凋亡率仅为10.8%。将GRP78
沉默后,细胞的凋亡率为24.6%,沉默GRP78并合用顺铂进行刺激,细胞的凋亡率为48.9%,明显高于单用顺铂组。用顺铂刺激
乳腺癌细胞MDA-MB-231 GRP78表达先上调后有减弱趋势,而siRNA转染沉默GRP78后,GRP78表达明显下降。结论抑制
GRP78的表达可以增加乳腺癌细胞的凋亡率,为乳腺癌的临床治疗提供了新的靶点。
     

靶向Twist基因逆转卵巢癌耐药细胞化疗敏感性的研究

目的 探讨载体表达的小干扰RNA(siRNA)影响卵巢癌耐药细胞株Twist基因的表达、促进凋亡并逆转其阿霉素耐药的可行性.方法 体外构建Twist小发卡状RNA(shRNA)的表达质粒,脂质体法介导将其转染入SKOV3/ADM细胞.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Twist mRNA的表达;使用免疫细胞化学法(ICC)检测Twist蛋白的表达;使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定各组细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测其对卵巢癌细胞凋亡的影响.结果 Twist shRNA转染组细胞Twist mRNA 的表达与其他两组相比明显减弱,Twist蛋白表达明显下调,差异均有统计学意义(P<0.01);阿霉素敏感性比正常对照组提高了约2.5倍;流式细胞仪显示阿霉素作用24 h后,特异性转染组细胞周期分布发生明显改变,G0/G1期细胞比例增多,而S期细胞比例减少,凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 针对TWIST合成的siRNA能够有效地抑制TWIST mRNA和蛋白的表达,促进卵巢癌耐药细胞凋亡并能恢复其对阿霉素的敏感性.应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性.     

RNAi抑制NF—KB基因增强肺癌细胞对TRAIL敏感性的研究

目的:探讨RNAi靶向沉默NF-κB基因对TRAIL诱导肺癌细胞凋亡的影响.方法:使用NF-κB p65 siRNA转染肺癌A549细胞48 h,实验分为空白对照、脂质体对照以及干扰实验3组.采用RT-PCR法测定肺癌A549细胞内NF-κB p65 mRNA的表达,MTT法检测siRNA转染前后TRAIL对A549细胞生长抑制作用的变化.结果:与空白对照和脂质体对照组相比,siRNA组具有明显抑制肺癌A549细胞NF-κB p65mRNA表达的作用(P<0.01).MTT实验表明,转染siRNA后TRAIL对A549细胞的生长抑制作用明显增强,但在同一浓度,转染NF-κB p65 siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05).结论:应用RNAi技术可有效干扰NF-κB p65的表达,抑制肺癌A549细胞的增殖,并可增加肺癌细胞对TRAIL的敏感性.     

COX-2基因沉默对OS-RC-2细胞生长和侵袭能力的影响

目的：观察RNA干扰沉默肾癌细胞株OS-RC-2的环氧合酶-2（COX-2）基因表达对肾癌细胞生长及体外侵袭能力的影响。方法：构建靶向COX-2的小干扰RNA（siRNA）真核表达质粒pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA。将对数生长期的OS-RC-2细胞分3组,干扰组转染pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA,空转组转染pSliencer2.0-U6,对照组不转染。培养72h后采用半定量RT-PCR、Westernblot检测COX-2mRNA和蛋白表达,CCK8增殖抑制实验观察细胞生长情况,改良Boyden小室法评估细胞体外侵袭能力。结果：酶切和测序证实pSilencer2.0-U6-COX-2-siRNA构建成功。3组细胞COX-2mRNA和蛋白的表达、细胞存活率及穿孔细胞数差异均有统计学意义（F分别为189.800,89.326,188.403和75.349,P均〈0.001）。与其他2组比较,干扰组COX-2mRNA及蛋白表达下调（P〈0.05）,细胞存活率、穿孔细胞数降低（P〈0.05）。结论：COX-2有望成为肾癌基因治疗的靶点。     

肺癌原代细胞耐药基因的表达和化疗敏感性的研究

目的探讨ATRA与VD3逆转肺癌细胞多药耐药，提高肺癌细胞化疗敏感性的机制。方法应用原代细胞培养、MTT比色、RT—PCR等方法观察ATRA联合VD3对人肺癌原代细胞、肺腺癌A549细胞株化疗敏感性及MRP、LRP表达水平的影响。结果人肺癌原代细胞MRP、LRP高表达，其表达与肿瘤病理无明显相关，MRP表达阳性与ADM、VP-16、VCR的耐药相关，LRP表达阳性与DDP、CBP、ADM、VP-16、VCR的耐药相关。结论MRP、LRP在肺癌尤其非小细胞肺癌中高表达，可反应肿瘤细胞多药耐药性；ATRA或VD3可下调肺腺癌MRP、LRP基因的表达水平，从而提高肺腺癌的化疗敏感性。     

Bcl-2siRNA增强SGC-7901胃癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

药物耐药性是目前导致肿瘤化疗失败的重要原因,不断研究新的克服耐药的有效途径,提高患者存活率是当前肿瘤治疗迫切需要解决的重要课题。肿瘤耐药机制复杂,已证明凋亡相关基因表达异常与肿瘤耐药密切相关。bcl-2是一种抗凋亡蛋白,过度表达致肿瘤细胞凋亡受抑制,同时对多种化疗药物耐药(1-3)。RNA干扰技术是近年发