X-盒结合蛋白1条件性基因敲除小鼠模型的建立

目的建立可进行条件性敲除X-盒结合蛋白1(Xbp1)基因的flox杂合子小鼠。 方法通过ET-clone的方法构建基于cre-loxp系统和FLP-frt系统的条件性基因打靶载体。载体线性化后电转JM8A3 ES细胞,经G418和Ganc筛选获得抗性ES细胞克隆。经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。 结果成功构建打靶载体,共获得144个抗性ES细胞,克隆经长片段PCR鉴定,共获得4个正确同源重组的阳性克隆。获得4只阳性F1代小鼠,经测序鉴定正确。Xbp1基因flox杂合子小鼠表型无明显异常。 结论成功构建了条件性敲除Xbp1基因的flox杂合子小鼠,为未来研究器官或组织特异性的Xbp1生物学作用奠定了基础。     

基于Cre/LoxP系统建立睾丸Occludin基因敲除小鼠模型

目的:基于Cre/LoxP系统建立睾丸Occludin基因敲除小鼠模型,并进一步观察其表型变化差异。方法:使用Cre-LoxP系统构建Occludin-floxed(基因型Floxp/-)小鼠,与AQP2-cre(基因型Cre/-)小鼠进行杂交,得到睾丸内Occludin条件性敲除小鼠(基因型Floxp/Floxp Cre/-。利用PCR及Southern印迹技术鉴定F1代敲除小鼠基因型,利用qPCR,Western印迹以及免疫组化鉴定Occludin敲除小鼠中Occludin蛋白表达来验证Occludin敲除小鼠获得成功。比较实验鼠与正常鼠的精子数量,分析其生育能力。结果:Southern印迹和PCR结果我们成功地获得了Occludin基因敲除的目标小鼠。Occludin基因敲除小鼠较正常小鼠Occludin蛋白表达减少,精子数量减少,生育能力降低。差异显著(P0.05)。结论:采用Cre-LoxP技术可成功构建Occludin基因敲除小鼠,并且Occludin的缺乏会对小鼠的生殖功能产生影响。     

间质细胞双尾C基因条件性敲除小鼠模型建立及其表型分析

目的构建间质细胞双尾C(Bicc1)基因条件性敲除小鼠模型, 并对其表型进行分析。方法将CRISPR Cas9方法构建的Bicc1f/+小鼠子代与Pdgfra启动子驱动的Cre小鼠进行杂交, 获得子代小鼠, 饲养1～2周后提取其脚趾及鼠尾组织基因组DNA, 经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后, 在DNA水平检测小鼠基因型;选取经鉴定后生长至3周龄的Bicc1基因条件性敲除小鼠(实验组)、野生型小鼠(对照组)各3只进行后续实验:通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导敲除Bicc1基因, 于1周后取小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤及脂肪组织, 一部分组织通过实时定量PCR(RT-qPCR)鉴定其中的Bicc1 mRNA表达水平;另一部分组织以10%多聚甲醛固定, 随后进行HE染色和Masson染色, 在光镜下观察分析。应用SPSS 28.0软件对数据进行分析, 组间比较采用t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。结果通过繁育获得间质细胞Bicc1基因条件性敲除小鼠, 基因型为Bicc1f/fCre+/-, 野生型小鼠基因型为Bicc1f/fCre-/-;RT-qPCR检测结果显示, 实验组小鼠肾脏、骨骼...     

益气化瘀方减轻HIF-1α条件性基因敲除小鼠膝关节软骨退变的研究

目的:观察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)条件性基因敲除(HIF-1αcKO)小鼠膝关节软骨退变情况,以及中药复方益气化瘀方对减缓HIF-1αcKO小鼠椎间盘软骨退变的作用。方法:①将杂交繁殖获得同窝的HIF-1α+/+小鼠和HIF-1α-/-小鼠,分为HIF-1α+/+小鼠4月龄组、HIF-1α-/-小鼠4月龄组,HIF-1α+/+小鼠6月龄组、HIF-1α-/-小鼠6月龄组,每组3只。在4、6月龄依次处死相应的小鼠,取膝关节软骨,分别进行Mankin评分、藏红固绿、HE及免疫组化相关指标染色及分析,研究软骨组织的改变情况。②将2月龄HIF-1α-/-小鼠随机分为生理盐水组和益气化瘀方组,以生理盐水组小鼠作为正常对照,每组6只,共12只。灌胃给药2个月后,取各组小鼠的膝关节,分别进行Mankin评分、HE染色和藏红固绿染色,ColⅡ、ColX、VEGF、MMP-13和Sox9免疫组化染色及分析。结果:①HIF-1α-/-小鼠4月龄组膝关节软骨组织出现破损和骨化,细胞分布不均匀,软骨细胞减少。HIF-1α-/-小鼠6月龄组膝关节软骨损伤更加严重。HIF-1α-/-小鼠4月龄组椎间盘软骨中Ⅱ型胶原(ColⅡ)和Sox9表达降低,X型胶原(ColX)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、VEGF蛋白表达增加。HIF-1α-/-小鼠6月龄组ColⅡ蛋白与Sox9表达进一步降低,ColX、MMP13、VEGF蛋白表达进一步上升。②与生理盐水组比较,益气化瘀方干预后膝关节软骨部位的骨化和缺损减轻,软骨细胞分布较均匀,细胞总数增加。免疫组化染色显示,益气化瘀方组ColⅡ和Sox9蛋白的表达升高,ColX、VEGF、MMP-13蛋白表达减少。结论:HIF-1α基因敲除小鼠出现了膝关节软骨退变,并且这种退变随着小鼠增龄而加重;益气化瘀方可以减轻HIF-1α基因敲除小鼠的膝关节软骨退变。     

脊髓Caprin-1介导的CaMKⅡα表达与小鼠痛觉感知的关系

目的评价脊髓胞质活化/增殖相关蛋白1(Caprin-1)介导的钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡα)表达与小鼠痛觉感知的关系。方法通过NestinCreERT2小鼠与Caprin-1flox/flox小鼠多代杂交, 获得NestinCreERT2;Caprin-1flox/flox纯合子小鼠, 采用随机数字表法分为2组(n=5):NestinCreERT2;Caprin-1flox/flox溶剂对照组(SC组)和Caprin-1敲除组(KO组)。KO组连续5 d腹腔注射他莫昔芬100 mg/kg, 以诱导性敲除Caprin-1基因, SC组给予等容量溶剂。于连续给药前1 d和给药结束后5 d时测定机械缩足反应阈(MWT)。随后处死小鼠, 取脊髓L4-6节段, 采用Western blot检测脊髓Caprin-1、CaMKⅡα表达, 采用实时定量PCR法检测脊髓Caprin-1、CaMKⅡα的mRNA表达, 采用免疫荧光双标染色检测Caprin-1与CaMKⅡα共表达情况。结果与SC组比较, KO组他莫昔分给药结束后5 d时MWT升高, 脊髓Caprin-1及其mRNA、CaMKⅡα...     

Smad4促进成骨分化的机制研究

目的 探讨Smad4基因促进成骨分化的作用机制。方法 采用条件性基因敲除技术Cre/loxp,制备骨细胞特异性敲除Smad4小鼠(Smad4otcko),小鼠胚胎骨骼透明染色分析胚胎期小鼠长骨生长状况;待小鼠成长至1月龄,X-ray检测突变小鼠与对照组小鼠的骨密度差异;静态骨组织形态学分析检测突变鼠及对照鼠的骨量变化、成骨细胞数量变化等差异;实时荧光定量PCR检测Smad4突变鼠股骨成骨细胞相关因子Runx2、ALP、OSX及OCN;破骨细胞TRAP染色分析Smad4突变鼠破骨细胞形态及数量变化;qPCR检测突变鼠股骨破骨吸收标志基因RANKL、OPG,并计算RANKL/OPG比率。结果 Smad4基因敲除小鼠在胚胎期未出现长骨生长异常。X线结果显示,1月龄时,与对照组小鼠相比,Smad4突变鼠的骨密度降低（P＜0.05）,静态骨组织形态学分析表明突变鼠松质骨减少,皮质骨变薄,骨小梁数量减少（P＜0.05）;Smad4突变鼠成骨细胞标志基因表达量显著降低,成骨细胞的数量明显减少（P＜0.05）;RANKL作为破骨吸收标志物表达上调、作为其拮抗剂的OPG表达量下调,RANKL/OPG比率增高（P＜0.05）。结论 Smad4基因通过促进成骨分化,降低破骨吸收从而来维持骨稳态。     

条件性敲除Osterix基因获得先天性脊柱侧凸小鼠动物模型及表型分析

目的 通过Osterix基因敲除获得先天性脊柱侧凸动物模型及表型分析.方法 应用Cre-LoxP系统繁育成骨细胞特异性敲除Osterix基因小鼠.取4、12周龄的敲除小鼠各10只,以同龄同系野生型小鼠各10只为对照,行全身及脊柱X线摄像观察;收集脊柱标本行苏木素-伊红(HE)染色及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察并检测.结果 成功获得成骨细胞特异性敲除Osterix基因小鼠,X线显示敲除小鼠中75％出现严重的脊柱侧凸,Cobb角平均值为35..HE染色显示敲除小鼠椎体生长板增宽,椎体骨量增加,TRAP染色显示腰椎中破骨细胞数量显著减少(P＜0.05).结论 小鼠成骨细胞中条件性敲除Osterix基因后成功获得先天性脊柱侧凸模型,提示Osterix在先天性脊柱侧凸的发病中有重要作用.     

Indian Hedgehog信号通路在软骨细胞成熟及转分化过程中的调控作用

目的 探究Indian Hedgehog（IHH）信号通路对软骨内成骨过程中软骨细胞成熟以及转分化的影响。方法 取10日龄野生型小鼠的胫骨组织,采用原位杂交和免疫组织化学染色检测生长板区域IHH信号通路相关分子Ihh、Ptch1和Gli1的表达水平。构建肥大软骨细胞特异性Ihh基因敲除小鼠（Col10a1^Cre/+; Ihh^null/C）,并采用影像学检查和阿利新蓝染色评估该小鼠的骨骼发育状况。构建肥大软骨细胞IHH信号通路持续激活小鼠（Col10a1^Cre/+; R26Smo^M2/M2和 Col10a1^Cre/+; Ptch1^LacZ/C）,采用HE染色、原位杂交和TUNEL染色分别对受精15.5天胎鼠胫骨组织形态结构、Ihh（肥大软骨细胞分子标志物）和Col1a1（成骨细胞分子标志物）以及肥大软骨细胞凋亡水平进行检测;另外应用HE染色对10日龄小鼠的胫骨组织进行组织学分析。结果 肥大软骨细胞合成分泌IHH,但不表达Ptch1和Gli1。抑制肥大软骨细胞合成IHH蛋白会导致出生后小鼠出现侏儒症;X线检查结果显示小鼠出现严重的骨骼发育不良,包括胸廓狭小、球形头骨以及椎骨发育异常等表现。持续启动IHH信号通路时,胚胎早期软骨细胞成熟分化过程虽未见异常,但是出生后小鼠的骨小梁、骨内膜以及皮质骨等结构均出现一定的异常表现。结论 IHH信号通路虽然不参与肥大软骨细胞的终末分化过程,但在软骨细胞转分化的过程中起到了重要的调控作用。     

雄性不育相关基因敲除小鼠模型

男性不育的发生机制复杂,建立雄性不育的动物模型,特别是小鼠模型,为研究不育相关基因功能和分子机制提供了模型基础,目前用于生物医学研究的小鼠模型主要有3种类型,例如敲除/敲入/基因捕获方法获得小鼠,转基因小鼠和化学诱导的点突变小鼠。本文对雄性不育相关基因敲除的小鼠模型进行了总结,以期为研究男性不育的发病机制寻找合适的动物模型。     

雄激素受体敲除后雄性小鼠的泌尿生殖系统表型

目的　了解敲除雄激素受体 (AR)后雄性小鼠的泌尿生殖系统表型。　方法　采用Cre lox技术 ,雌性Flox AR小鼠与雄性ACTB Cre小鼠交配 ,PCR方法检测子代小鼠尾巴的基因型 ,筛选出AR敲除小鼠 5只 ,5只AR未被敲除的小鼠作为对照。比较 2组小鼠的泌尿生殖系统表型 ,测量肛门生殖器距离、睾丸重量、血清睾酮及雌二醇浓度。　结果　AR敲除 (ARKO)组小鼠肛门生殖器距离为 (0 .5± 0 .1)cm ,对照组为 (1.1± 0 .1)cm。ARKO组前列腺、精囊、附睾及球海绵体肌均缺如 ,睾丸显著缩小 ,重量 (0 .0 0 6± 0 .0 0 1) g ;对照组前列腺、精囊、附睾及球海绵体肌发育正常 ,睾丸重量为 (0 .0 86± 0 .0 0 2 ) g。ARKO组血清睾酮浓度 (0 .0 5 6± 0 .0 4 5 )nmol/L ,雌二醇浓度 (1390 .1± 2 94 .3) pmol/L ,对照组睾酮浓度 (0 .84 3± 0 .736 )nmol/L ;雌二醇浓度 (786 .2± 15 0 .8) pmol/L。差异均有统计学意义 (P <0 .0 5 )。　结论　敲除雄激素受体后 ,小鼠前列腺、精囊、附睾及球海绵体肌缺如 ,睾丸缩小 ,雄激素水平降低 ,雌激素水平升高 ,提示AR在雄性小鼠泌尿生殖系统发生及雄激素水平调节中发挥重要作用。