超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的操作条件优化研究

目的:重点在于摸索超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的最佳操作条件。方法:以新鲜红地龙的匀浆液为分离对象,以10万膜分离过程为目标过程,以膜通量为指标,来优化压力、温度、表面转速、料液浓度等操作条件。结果:(1)最佳操作条件为:0.25MPa,30°C,200r/min,pH=6.7,地龙浓度为33.3%(w:w),氯化钠的加入量为0。(2)红地龙匀浆液中蛋白物质分子量主要分布在5万~10万。结论:所得实验结果为中试或工业生产提供理论基础和数据支持。     

无机陶瓷膜分离地龙匀浆液中药效物质的操作条件优化研究

目的:摸索无机陶瓷膜分离地龙匀浆液中药效物质的最佳操作条件.方法:以膜通量为指标,筛选合适的膜材质,优化压力、温度、浓度等操作条件.结果:显示膜通量随过滤压差、温度增加而呈现上升趋势,随浓度的上升而下降.结论:通过比较膜通量的大小和膜通量的衰减速度,分级分离时一级膜管选择0.2 μm Al2O3、二级膜管选择50 nm ZrO2,最佳操作条件:0.15 mPa、50℃、33.3%的料液浓度.     

两种常用膜对地龙匀浆液有效成分分级分离效果的比较

目的 明确两种常用膜聚偏氟乙烯(PVDF)及无机陶瓷膜对地龙匀浆液中有效成分分级分离效果的优劣,从而选择理想的膜分离材料.方法 在最优分离操作条件下,分别用截留分子量(MWCO)为100 000、50 000、10 000的PVDF滤过膜及0.2μm Al203、50 nm ZrO2无机陶瓷膜管对地龙匀浆液分级分离,留取截留液和滤过液,采用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定蛋白含量、SDS-PAGE测定蛋白分子量的分布、纤维蛋白平板法测定纤溶活性.结果 PVDF分级分离地龙匀浆液,有效成分截留率高,蛋白损失率小;SDS-PAGE显示活性蛋白成分分子量在10 000～100 000之间,有纤溶活性的成分分子量在10 000～50 000,用50 000膜分离时能得纤溶活性高的液体,提纯分离效果好.结论 PVDF对地龙匀浆液分离效果优于无机陶瓷膜.     

有机膜分离法比较酶解对地龙纤溶、降压活性的影响

目的:研究模拟胃肠道系统酶解对地龙膜分离后活性部位纤溶、降压作用的影响。方法:对酶解前后新鲜红地龙的匀浆液采用不同孔径的聚偏氟乙烯膜进行超滤,对超滤液进行纤溶和血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的测定。结果:酶解后匀浆液的纤溶活性总体基本没有改变,但分子量大的部位纤溶活性下降,而分子量小的部位则上升;ACE抑制活性随着酶解得到提高,以4千膜的滤过液为最。结论:消化道酶解不会降低地龙的纤溶活性,地龙匀浆后以分子量为1万的膜进行截留,可得到纤溶活性更强的部位;地龙的降压作用经过胃肠道的酶解会得到增强,先行酶解会有益于降压作用的提高。     

地龙活性提取物的主要药效学试验

目的：研究鲜地龙水匀浆液提取物的活血化瘀药效学试验。方法：通过对实验性大鼠脑梗死引起损伤的影响；对麻醉犬脑血流量及脑血管阻力的影响及对大鼠血小板功能的影响等5个方面进行了试验。结果：地龙活性提取物具有减少或修复因脑缺血引起的组织损伤和增加脑血流量、减少脑血管阻力、降低血小板粘附和延长动物体内血栓形成等作用。结论：地龙活性提取物不仅具有尿激酶的激活作用，溶解新鲜血栓，同时还能溶解陈旧血栓。     

正交试验优选酒炙广地龙炮制工艺

目的：优选出酒炙广地龙最佳炮制工艺。方法：以次黄嘌呤的含量为评价指标,选择加酒量、闷润时间、烘干温度三个主要影响因素,用L9（3^4）正交设计表,采用方差分析法,对广地龙进行酒炙工艺的优选。结果：酒炙广地龙的最佳炮制工艺,每20g饮片,加10ml黄酒,闷润50min,40℃干燥。结论：本方法为规范酒炙广地龙的炮制工艺,提高酒炙广地龙的质量,提供了科学依据。     

地龙提取物制备工艺优化对其抗凝血作用及氨基酸含量的影响

目的：探讨地龙提取物制备工艺优化对其抗凝血作用及氨基酸含量的影响。方法：选择煎煮时间、醇沉比例和干燥方式作为影响因素，抗凝血效价和氨基酸含量作为评价指标，按L₉（3⁴）正交试验表设计方案，分析地龙提取物的制备工艺优化对抗凝血效价、氨基酸含量的影响。结果：煎煮时间（A）、醇沉比例（B）和干燥方式（C）对提取物抗凝血效价、氨基酸含量影响显著（P<0.05），影响大小排序为A>B>C；煎煮时间越长，醇沉比例越高，提取物的抗凝血效价、氨基酸含量越高；冷冻干燥制得提取物外观、颜色较好，抗凝血效价、氨基酸含量最高，含水量最低。以抗凝血效价、氨基酸含量为指标，最佳工艺为煎煮3 h，醇沉比例70%，干燥方式为冷冻干燥。以最佳制备工艺制备3批地龙提取物，外观疏松多孔、无塌陷，淡黄色，平均水分2.81%，平均抗凝血效价484 IU/mg，平均氨基酸总含量3.74%,3批各项指标相对标准偏差值<5%，批间差异小；氨基酸含量与抗凝血效价呈正相关（r=0.986,P=0.000）。结论：地龙提取物的制备工艺通过影响其氨基酸含量而影响抗凝血效价，...     

高效毛细管电泳法同时分离检测六种地龙多肽＊

地龙药用历史悠久，但目前未见对其活性多肽进行分离检测的报道。本文建立了一种同时分离检测六种地龙多肽的毛细管区带电泳新方法。实验发现，在以60 mmol·L^-1乙酸铵-50 mmol·L^-1氢氧化钠（pH = 8.0）为运行缓冲液，以20 kV为分离电压的分析条件下，六种地龙多肽可在10 min内到达基线分离。经方法学验证，六种多肽精密度良好，检测限（S/N = 3）可低至为1.0 μg·mL^-1。     

附子-甘草药对配伍前后汤液相态对比

目的： 对比分析附子-甘草配伍前后汤液的相态变化。 方法： 运用电导率仪、散射光浊度仪、旋转黏度计、表面/界面张力测定仪,在20,40,60 ℃时分别测定附子-甘草配伍前后汤液的理化参数（电导率、盐度、浊度、黏度、表面张力）;采用激光衍射法测定汤液的粒径和粒径分布,对比分析附子-甘草配伍前后汤液的相态变化。 结果： 附子-甘草配伍前后汤液相态的理化参数均有变化。附子-甘草合煎液汤液的电导率、盐度低于其他汤液,而合煎液中粒子粒径大于其他汤液。 结论： 为深入研究附子-甘草配伍前后汤液中增效减毒的物质基础及汤液相态变化提供实验基础。     

地龙水煎液对未孕大鼠离体子宫平滑肌作用的研究

目的：观察地龙水煎剂对未孕大鼠离体子宫平滑肌运动的影响，并初步探讨其作用机制。方法：运用BL一420生物信号系统记录离体大鼠子宫平滑肌每的活动，观察不同剂量地龙水煎荆对子宫平滑肌自发活动的影响。结果：地龙水煎剂有明显地兴奋作用，可增加收缩波持续时间，增加收缩张力及子宫活动力，并呈量效关系。地龙水煎荆的这一作用可被异搏定（L型电压依从性Ca^2＋通道阻断剂）完全阻断（P〈0．01）。结论：地龙水煎液在体外可增强子宫平滑肌的收缩，该作用可能是通过L型钙通道而发挥作用的。     

地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立地龙（参环毛蚓）药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据地龙氧化酶亚基1（COⅠ）基因序列筛选出地龙配方颗粒的稳定引物区间，并根据区间内筛选获得地龙的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计地龙特异性鉴别引物dlshmy-F及dlshmy-R，分别采集地龙及其混伪品，建立地龙配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。结果 退火温度为62 ℃，循环次数为36次，地龙及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后，可在约170 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，其他近源伪品如通俗环毛蚓、保宁腔蚓、栉盲环毛蚓等20种伪品及阴性对照均无条带。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法可快速准确的鉴别出地龙药材、配方颗粒、冻干粉中的参环毛蚓源性成分，准确鉴定出全国广地龙中药材及饮片以及地龙的基原，也可为其他的中药配方颗粒质量标准研究提供了参考。     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

血清放置不同温度对ALP活力测定的影响

目的：探讨血清放置25℃、37℃、56℃-ALP活力测定的影响；方法：166份血清标本，每份分成3组，每组吸取500微升放置室温（25℃）、37℃、560（210分钟，再测定ALP活力值。结果：同一份标本放置不同温度测定值不同。结论：ALP活力测定值在标本放置不同温度时不同，放置温度对ALP活力测定有影响。因此，测定ALP活力时，必须要注明温度。     

柱前衍生HPLC法测定地龙中氨基酸的含量

目的：分析地龙中氨基酸的含量及其特征性。方法：采用邻苯二甲醛（OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）联合柱前衍生HPLC测定地龙中的17种氨基酸,峰面积外标法定量。结果：各氨基酸在26min内可得到较好分离,氨基酸浓度与峰面积呈良好的线性关系,r值均在0.995以上。结论：所建立的方法分离效果好、灵敏、准确、简便,适宜地龙药材中氨基酸的测定。     

广地龙的X射线衍射Fourier谱鉴定

目的：建立中药材广地龙的鉴定新分析方法。方法；采用粉末X射线衍射Fourier谱地。结果；通过对1个广地龙药材对照品，4个广地龙中药材进行实验，分析，获得了广地龙的标准X射线衍射线Fourier图谱及特征标记峰值。结论：表明X射线衍射Fourier谱鉴定法可用于中药材广地龙的鉴定。     

广地龙纯化蛋白促进创伤修复作用机制研究

目的：研究广地龙纯化蛋白促进创伤修复的作用机制。方法：采用细胞计数试剂（CCK-8）法，检测给药后对人永生化角质形成细胞（HaCaT）和小鼠成纤维细胞（NIH3T3）增殖的影响；通过划痕实验，检测HaCaT细胞和NIH3T3细胞迁移的影响；利用羟脯氨酸检测试剂盒和酶联免疫吸附试验法，检测NIH3T3细胞培养上清中羟脯氨酸、胶原蛋白-Ⅰ和基质金属蛋白酶-1水平。结果：在一定范围内，地龙蛋白能促进HaCaT细胞和NIH3T3细胞增殖和迁移，分别在0.313 mg/mL和1.250 mg/mL时，细胞增殖活性最强，划痕愈合率最高；给药后NIH3T3细胞培养上清中羟脯氨酸、胶原蛋白-Ⅰ水平明显升高，基质金属蛋白酶-1水平显著降低，在1.250 mg/mL时，与对照组比较最显著。结论：广地龙纯化蛋白组分通过促进HaCaT细胞和NIH3T3细胞增殖和迁移，促进NIH3T3细胞胶原蛋白合成与分泌，抑制胶原蛋白降解，从而促进创伤修复。     

地龙对巨噬细胞免疫活性的增强作用

 目的：研究地龙的免疫作用，探讨地龙的促愈合机制。方法：给小鼠ip不同浓度的地龙提取液，测定腹腔巨噬细胞的活化率；用不同浓度的地龙提取液培养巨噬细胞，测定其吞噬中性红的能力及Fc受体活化的数量。结果：地龙能显著地提高巨噬细胞活化率、细胞表面Fc受体功能增强、提高其吞噬中性红的能力。结论：地龙能明显地增强巨噬细胞的免疫活性，可能对缩短炎症周期、促进伤口愈合起重要作用。     

连休蜈蚣地龙汤对支原体肺炎患儿免疫功能的影响

目的：观察连休蜈蚣地龙汤对支原体肺炎患儿T细胞亚群、炎症细胞因子及血清免疫球蛋白等免疫指标的影响。方法：选择65例支原体肺炎患儿随机分为2组。治疗组35例，采用连休蜈蚣地龙汤（由黄连、细辛、重楼、地龙、法夏、苦杏仁、羚羊角、桑白皮、地骨皮、蜈蚣、麻黄、丹参等组成）治疗；对照组30例，．采用阿奇霉素治疗。另选择同期体健检健康20例，设为健康对照组。主要观察淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及细胞因子等指标的变化。结果：治疗前治疗组、对照组淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及细胞因子等各项指标与健康对照组比较，差异有显著性或非常显著性意义（P〈0．05，P〈0．01）。治疗第3、5周，对照组IgG、IgM、CD4^＋、CD8＋和CD4^＋／CD8^＋与健康对照组比较，差异均有显著性意义（P〈0．05）；但治疗组除第3周CD4’明显低于健康对照组（P〈0．05），其余各项指标均与健康对照组接近（P〉0．05）。治疗第3、5周对照组TNF—a与健康对照组比较，差异有显著性或非常显著性意义（P〈0．05，P〈0．01）；治疗组治疗第3周IL-6、IL-8与健康对照组比较，差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：调节机体体液免疫和细胞免疫功能是连休蜈蚣地龙汤治疗支原体肺炎的重要作用机理之一。     

Box-Behnken设计-响应面法优化地龙活性组分的冻干工艺

目的优选地龙活性组分的冻干工艺。方法采用单因素试验结合Box-Behnken响应面法,以冻干率为指标,考察1次升华温度、升华时间、解析干燥温度、解析干燥时间等因素对冻干工艺的影响,优化地龙活性组分的冻干工艺,采用HPLC法,测定优化后工艺样品的指纹图谱,并比较其与地龙药材指纹图谱相似度,确定最佳冻干工艺。结果确定地龙活性组分的最佳冻干工艺条件:预冻温度-26.5℃,预冻4 h,升华干燥温度-20℃、升华时间7 h、解析干燥温度30℃、解析干燥时间3.5 h,冻干率为96.55%,与对照药材的氨基酸指纹图谱相似度均大于0.9。结论 Box-Behnken响应面法用于地龙活性组分冻干工艺条件的优选是可行的,模型预测效果较好,优化工艺具备可行性。     

补肾、健脾、活血三类中药复方对脑室内注射白细胞介素-1大鼠下丘脑单胺类神经递质变化的影响

目的：探索补肾、健脾、活血三类中药复方对免疫因子引起的下丘脑单胺类神经递质的不同影响。方法：用侧脑室注射白细胞介素 １β（ＩＬ １β），观测大鼠下丘脑匀浆液中单胺类神经递质的变化，建立一个下丘脑单胺类神经细胞功能对免疫因子的反应状态，以此观察三类中药对这一反应状态的不同影响。结果：侧脑室内注射ＩＬ １β能使下丘脑匀浆液中去甲肾上腺素（ＮＥ）含量明显降低；补肾的右归饮能使因侧脑室注射ＩＬ １β引起下丘脑匀浆液中去甲肾上腺素（ＮＥ）含量下降进一步明显降低；而健脾的四君子汤和活血的桃红四物汤则无明显变化。结论：补肾中药能增强下丘脑去甲肾上腺素神经元的活动，未能观察到健脾、活血中药有类似的作用。