雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因c DNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因c DNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果:根据分析结果Tw MO基因全长为2 193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 k Da,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwMO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示Tw MO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析

研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase)基因TwAACT进行全长cDNA(GeneBank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到TwAACT cDNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 kDa,在线预测表明TwAACT具有2个催化活性位点。雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,TwAACT相对表达量明显增加,在24 h达到最高。研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶,参与植物生长发育等重要生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长c DNA序列,并进行生物信息学分析;使用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到Tw KAO长度为1 874 bp,编码487个氨基酸,蛋白相对分子质量56.02 k Da,理论等电点8.89;经茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,Tw KAO基因相对表达量在12 h达到峰值;经植株组织表达分析证实,Tw KAO基因在雷公藤的叶中表达量最高,根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表达特征,为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础。     

雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)的cDNA全长克隆及表达分析

目的:克隆得到雷公藤一型4α-甲基氧化酶(Tw SMO1)(Gen Bank KX987126)全长基因,并对其进行序列分析及初步的功能验证。方法:根据雷公藤转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1),并利用相关软件对所得核酸序列及其所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞,用实时荧光定量(RT-PCR)的方法分析诱导不同时间点后雷公藤悬浮细胞中的TwSMO1基因的相对表达量。结果:克隆所得的TwSMO1基因cDNA全长1505 bp,开放阅读框900 bp,编码299个氨基酸,在线预测其所编码蛋白分子量为34.55 k Da,理论等电点为6.89。多重序列比对结果显示其与其他物种的SMO1氨基酸序列有较高同源性,且包含SMO1基因家族的3个保守域,系统进化树将其归为4α-甲基氧化酶第一家族基因,遂将其命名为TwSMO1。RT-PCR结果表明MeJA诱导后TwSMO1基因在1 h后表达量达到最高,约是对照组的450倍。结论:本研究首次克隆得到雷公藤TwSMO1基因,并对其进行生物信息学分析及MeJA诱导表达分析,为深入研究此基因功能及阐述雷公藤甾醇生物合成途径奠定基础。     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

雷公藤4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析

4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase, CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一。根据获得的雷公藤转录组数据中TwCMK片段设计特异性引物,采用全长PCR方法克隆TwCMK全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞后0~72 h TwCMK基因的表达水平。结果表明,TwCMK全长cDNA由1732个核苷酸组成,具有完整的开放阅读框,共编码387个氨基酸,蛋白相对分子质量为42.85 kDa,理论等电点为5.79;TwCMK基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础。     

多基原藏药材“美多罗米”中质量标志物的初步预测及分析

目的基于质量标志物(Q-marker)理念,从化学成分的角度对多基原藏药材"美多罗米"的质量标志物进行预测,评价其药材品质。方法首先基于亲缘关系与生源途径、药理作用与化学成分的关系,预测美多罗米的Q-marker;其次采用UHPLC同时测定其主要活性成分,采用Acquity UHPLC HSS C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);流动相为乙腈(A)-0.3%乙酸水(B),梯度洗脱,体积流量为0.21mL/min,柱温35℃,检测波长为320nm。结果预测咖啡酸类成分(绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸)是美多罗米的主要活性物质基础之一,可作为Q-marker的主要选择。建立了美多罗米中咖啡酸类成分的含量测定方法,绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸分别在9.60～480.00、10.27～513.50、10.08～504.03、9.64～482.80、3.82～380.24 mg/L线性关系良好,平均加样回收率分别为102.43%、99.78%、99.39%、103.12%、101.83%。各样品中均能检测出这5个成分,总含量在全草中均大于10%,提示这5个咖啡酸类成分可以作为美多罗米的Q-marker。结论以咖啡酸类成分作为美多罗米的Q-marker科学合理;建立的美多罗米多基原植物中咖啡酸类成分的UHPLC测定方法可用于美多罗米药材质量控制,为多基原药材合理评价提供新思路。     

皂角刺的高效液相指纹图谱分析及多组分测定

目的建立皂角刺的HPLC指纹图谱,并同时测定皂角刺中7,3′,5′-三羟基-5-甲氧基二氢黄酮醇、3,3′,5,5′,7-五羟基二氢黄酮醇、槲皮素3种黄酮类成分的量。方法采用Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)溶液,梯度洗脱,0~5 min,5%~13%A;5~20 min,13%~16%A;20~45 min,16%~20%A;45~50 min,20%~25%A;50~65 min,25%A;65~80 min,25%~40%A;体积流量0.9 m L/min;柱温25℃;检测波长338 nm。结果对13批皂角刺药材进行研究,所得HPLC指纹图谱共标定14个共有峰,并对其中3个成分进行了测定,其质量浓度分别在0.091 3~5.840 0、0.176 3~11.280 0、0.014 0~0.895 0 mg/m L与峰面积呈良好线性关系(r≥0.999 2),平均加样回收率为98.97%~99.66%,RSD2.5%。结论该法具有较好的稳定性和重复性,为皂角刺药材的质量控制提供科学依据。     

雷公藤诱导细胞凋亡的研究进展

雷公藤Tripterygium wilfordii提取物在临床上常用于治疗类风湿关节炎等多种疾病，其疗效已被广泛认可，近5年来国内外学者从其提取物诱导细胞凋亡的角度，对其药理机制进行了细胞分子水平的探讨，现对其研究进展进行综述。     

雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析

该研究利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条GGPPS全长c DNA(Gene Bank:KM978333),并对其进行多重序列比对、蛋白结构预测及构建系统进化树等生物信息学分析。所克隆的Tw GGPPS c DNA全长1 857 bp,编码含514个氨基酸的蛋白序列,相对分子质量为57.13 k Da,等电点为7.85,具有5个保守域和2个功能域,亚细胞定位预测显示其可能位于质膜上,多重序列比对及系统进化树结果显示与其他植物GGPPS家族具有较高同源性。实验首次克隆了雷公藤GGPPS基因,为进一步研究雷公藤甲素等二萜化合物生物合成途径奠定基础。     

雷公藤中倍半萜生物碱类化学成分的研究

目的 对雷公藤Tripterygium wilfordii乙醇提取物氯仿部位中的倍半萜生物碱类成分进行研究。方法 采用酸提碱沉法,结合中性氧化铝、十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）及半制备高效液相等多种色谱技术进行分离纯化,并运用1D-NMR、2D-NMR、MS、ECD等波谱学方法对化合物进行结构鉴定。结果 从雷公藤乙醇提取物氯仿部位中分离得到5个倍半萜生物碱类成分,分别鉴定为(1S,4S,5R,6R,7R,8S,9S,10S)-1,8,11-triacetoxy-7-nicotinoyloxy-4,5-dihydroxy-dihydroagarofuran(1）、triptersinine U(2）、macroregeline F(3）、雷公藤宁碱B(4）和triptonine B(5）。结论 化合物1为新化合物,命名为雷公藤司宁Z15;化合物3为首次从该植物中分离得到。     

雷公藤治疗类风湿性关节炎研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜持续炎症和关节软骨及骨质破坏为特征的慢性自身免疫性疾病,随着人口老龄化不断加剧,RA的发病率逐年升高,公共卫生负担日趋严重。雷公藤具有祛风通络、除湿止痛、解毒杀虫的功效,临床常用于治疗多种自身免疫性疾病、肿瘤及皮肤病等,尤其在治疗RA方面疗效显著。从实验药理学与临床研究2个方面系统综述近年来雷公藤治疗RA的最新研究进展,包括雷公藤单味药应用、雷公藤与其他中药配伍应用以及雷公藤与化学药联合用药,以期促进雷公藤用于RA治疗的创新药物研发与临床合理有效应用。