RBL-2H3 细胞在药理学研究上的应用

 目的 根据大鼠嗜碱性白血病细胞（basophilic leukemia cell line 2H3,RBL-2H3）的生物活性特征和体外培养的特点,对近年来 RBL-2H3 细胞在药理学研究上的应用进行综述。 方法 通过对国内外文献的整理,分析和归纳,较为全面的描述RBL-2H3 细胞在药理学研究上的应用。结果和结论 RBL-2H3 细胞广泛用于研究 FcεRI 结构,以及受体配体反应介导的信号途径及其分子机制的研究,并且作为体外筛选抗过敏药物细胞模型。此外,RBL-2H3 细胞也可用于细胞分泌的生化途径、特定基因功能的研究。RBL-2H3 细胞膜富含受体,离子通道等,为其在仪器分析上的应用提供了有利条件。     

喜树幼苗中喜树碱及其代谢相关酶类的分布

目的分析当年生喜树Camptotheca acuminata幼苗各部位中喜树碱的量及其生物合成途径中色氨酸合酶(TSB)和色氨酸脱羧酶(TDC)的活性。方法用HPLC检测温室内不同氮素形态下砂培喜树幼苗各部位中喜树碱的量及TSB和TDC活性。结果不同氮素形态下喜树幼苗幼叶中喜树碱量明显高于其他器官(P<0.01),其次为茎皮和成叶,根中的最低。TSB活性在不同氮素形态下以幼叶最高,茎皮、成叶和根依次减弱,与喜树碱量呈现良好的器官对应性。不同氮素形态下TDC活性的最高部位为茎皮,其次为幼叶,成叶和根很低,与喜树碱的量缺乏器官对应性。结论当年生喜树幼苗喜树碱量以及TSB和TDC活性存在明显的组织器官特异性,喜树碱的量和TSB活性最高部位为幼叶,茎皮中TDC活性最大。     

几种常见中药注射剂对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

目的 通过研究几种常见中药注射剂(TCMI)对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,探讨RBL-2H3细胞模型应用于体外评价TCMI引起类过敏反应的可行性.方法 体外培养RBL-2H3细胞,血塞通等7种TCMI与其共同培养,通过中性红染色法计数脱颗粒的RBL-2H3细胞,显色法计算β-氨基己糖苷酶释放率,ELISA法检测培养上清中组胺含量,观察TCMI对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响.结果 正常RBL-2H3细胞出现少量脱颗粒现象,血塞通、清开灵、双黄连、脉络宁、香丹、穿琥宁等能显著引起细胞脱颗粒;血塞通、穿琥宁和柴胡注射液能不同程度促进β-氨基己糖苷酶的释放;血塞通、清开灵注射液可显著引起RBL-2H3细胞组胺释放.结论 RBL-2H3细胞脱颗粒的检测方法敏感、重复性好,其结果与临床报道有一定的相关性,提示其有评价TCMI所致的类过敏反应的潜在应用价值.     

资木瓜乙酸乙酯萃取物对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

目的研究资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法测定不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞活性的影响,采用底物法检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对不同抗原引起的细胞内β-氨基己糖苷酶释放的影响,采用流式细胞分析仪检测不同浓度资木瓜乙酸乙酯萃取物对细胞表面受体FcεRIα表达的影响。结果在一定浓度范围内,对细胞活性没有显著性影响的资木瓜乙酸乙酯萃取物可显著抑制细胞内β-氨基己糖苷酶的释放和降低细胞表面受体FcεRIα的表达,且呈量效关系。结论资木瓜乙酸乙酯萃取物对RBL-2H3细胞脱颗粒具有显著的抑制作用,其作用可能与RBL-2H3细胞表面受体FcεRIα的表达降低有关。     

木贼麻黄茎木脂素成分及其抗哮喘活性

目的 研究木贼麻黄Ephedra equisetina Bunge.茎中木脂素，并考察其抗哮喘活性。方法 木贼麻黄70%乙醇提取物采用硅胶柱、Sephadex LH-20、HPLC进行分离纯化，根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用底物显色法检测C48/80诱导的大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)的β-氨基己糖苷酶释放率。结果 从中分离得到22个化合物。化合物1能抑制β-Hex释放，改善RBL-2H3脱颗粒现象。结论 化合物1～22为首次从该植物中分离得到，其中化合物1具有潜在的抗哮喘活性。     

滇龙胆裂环烯醚萜类活性成分积累规律的研究

目的探讨同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花中裂环烯醚萜类主要活性成分的积累规律。方法采用高效液相色谱法(HPLC)测定同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷等主要活性成分的含量,并建立其HPLC图谱,对滇龙胆不同部位中主要活性成分积累规律进行研究。结果同一居群滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量极显著高于叶、花和茎(P0.01),滇龙胆叶中獐芽菜苦苷含量极显著高于根及根茎、花、茎(P0.01),滇龙胆花中獐芽菜苷含量显著高于根及根茎(P0.05);同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花HPLC图谱相似度在0.986以上,确定HPLC图谱中26个共有峰。结论同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷含量存在极显著(P0.01)或显著(P0.05)差异;滇龙胆根及根茎、叶、花HPLC图谱相似度较高,主要活性成分种类差异较小。     

知母不同药用部位体外抗肿瘤、抗炎及抗氧化的作用研究

目的：比较知母药材不同药用部位体外抗肿瘤、抗炎及抗氧化的作用,为知母进一步的合理应用和开发提供参考。方法:采用HPLC色谱法建立知母药材不同药用部位的指纹图谱,并进行相似度评价;采用MTT法研究知母不同药用部位对人胃癌HGC-27细胞、人肝Hepg-2细胞和人结肠癌Caco-2细胞体外增值抑制作用的影响;采用LPS诱导Raw 264.7细胞炎症模型,MTT法测定细胞活力,Griess试剂盒测定细胞分泌一氧化氮（NO）的水平,探讨知母不同药用部位的体外抗炎活性;采用二苯基苦酰肼基（DPPH）、2,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS）自由基清除法观察知母不同药用部位的体外抗氧化作用。结果：HPLC指纹图谱显示,知母4个不同药用部位根、茎、叶、花的化学成分具有一定的差异性;体外药效结果显示,知母不同药用部位作用于不同肿瘤细胞后均呈现不同程度的增值抑制作用,具有一定的差异性;知母不同药用部位均能促进RAW264.7巨噬细胞的增殖,不同药用部位对LPS诱导的巨噬细胞分泌一氧化氮均有不同程度的抑制作用;知母花对DPPH及ABST的清除能力最强,其它部位活性顺序依次为知母叶、茎、根。结论：知母根、叶、花为抗肿瘤有效药用部位;知母不同药用部位均具有显著的抗炎、抗氧化作用,以知母茎抗炎作用最强,知母花抗氧化作用最强;本研究为知母不同药用部位针对不同疾病的合理使用提供实验依据和实验方法。     

实时细胞分析技术结合模式识别评价祖师麻注射液类过敏反应

建立一种体外类过敏反应评价方法,快速评价不同厂家15批次祖师麻注射液的类过敏反应。采用体外嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞模型,选择Compound 48/80为阳性药,利用实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)系统检测药物干预后引起的细胞指数(cell index,CI)变化,并利用甲苯胺蓝染色法观察细胞形态、骨架变化验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。采用聚类方法对15批祖师麻注射液作用于RBL-2H3细胞后的CI进行分析。结果表明,Compound 48/80(20μg·mL~(-1))使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象。CI在加药30 min内快速下降,之后下降趋势变缓,提示RTCA系统可以快速敏感地评价RBL-2H3细胞脱颗粒作用。15批祖师麻注射液对RBL-2H3细胞的CI结合聚类分析(CA),提示不同厂家的祖师麻注射液对RBL-2H3细胞影响不同,S1～S8与Compound 48/80组聚为一类,提示该样品可能潜在临床类过敏反应;S9～S15与空白对照组聚为一类,提示该样品无类过敏样反应。该研究建立了一套基于RTCA系统结合模式识别的类过敏反应体外快速评价技术,可用于中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。     

雷公藤不同部位及制剂中5种萜类化合物HPLC-ELSD分析研究

目的:采用高效液相-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)分析法,比较雷公藤根、茎、叶、嫩枝、根皮、去皮根等不同部位及不同厂家制剂中雷公藤甲素、雷公藤氯化内酯醇、雷公藤内酯甲、雷公藤棕素及去甲泽拉木醛5种萜类化合物的含量。方法:采用HPLC-ELSD法分析,色谱柱:安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C8柱(4.6mm×250mm,5μm),采用二元流动相进行梯度洗脱,流动相A:0.05%甲酸的水溶液,流动相B:0.05%甲酸的乙腈溶液,检测雷公藤不同部位及不同厂家制剂中萜类化合物的含量,并建立高效液相色谱指纹图谱分析。结果:5种萜类化合物在雷公藤不同部位的含量差别显著,根中雷公藤甲素、雷公藤氯化内酯醇、雷公藤棕素及去甲泽拉木醛含量相对其他部位最高,根皮中雷公藤内酯甲含量最高,其次为茎与嫩枝,而去甲泽拉木醛仅在茎、嫩枝、根和根皮中测得,叶与去皮根中未能检测到。结论:HPLC-ELSD分析法是一种全面通用、快速便捷、灵敏度高的分析方法,可为雷公藤药材不同部位及其制剂的鉴别及质量控制提供依据,有利于其进一步深入开发与利用。     

苗族药飞龙掌血不同药用部位化学成分差异对比研究＊

目的 本研究建立飞龙掌血叶、茎皮和根皮HPLC指纹图谱，分析其化学成分差异，为不同药用部位应用合理性提供依据。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱：Agilent SB C₁₈柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），波长：320 nm，体积流量：1.0 mL/min，柱温：28℃，乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度系统。通过对飞龙掌血叶、根皮、茎皮对比研究，本研究建立飞龙掌血的指纹图谱，并运用相似度评价软件对指纹图谱进行相似度对比。结果 本研究发现相同药用部位的10批之间的相似度均大于0.93，其生成的对照指纹图谱具有代表性，可用于飞龙掌血指纹图谱比较。经对比叶、根皮、茎皮分别有14、15、15个共有峰。根皮与茎皮两者化学成分相近，叶与根皮和茎皮的化学成分差异明显。结论 飞龙掌血不同药用部位的内在质量存在一定差别，此法可用于飞龙掌血药材的的真伪鉴别和质量评价。     

不同产地老鹳草指纹图谱的建立及抗肿瘤谱效关系研究

目的 建立老鹳草Geranium wilfordii指纹图谱,研究老鹳草提取物的指纹图谱与抗肿瘤活性之间的谱效关系,初步明确老鹳草抗肿瘤主要活性成分。方法 运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件,建立老鹳草抗肿瘤活性部位的HPLC指纹图谱。采用MTT法,以人乳腺癌MCF-7细胞为模型,对老鹳草样品的醋酸乙酯部位进行抗肿瘤活性测定。采用多元线性回归法,将量化共有峰面积与MTT法测得老鹳草抗肿瘤活性结果相结合,构建老鹳草抗肿瘤谱效关系。结果 通过指纹图谱的建立,共标定了16个共有峰,确定1号峰为没食子酸、7号峰为柯里拉京、8号峰为老鹳草素、12号峰为鞣花酸。其中29批药材的相似度均大于0.732,运用主成分分析和聚类分析进一步分析样品间差异,将距离较远的30号样品排除。HPLC指纹图谱中的16个共有峰中,有8个峰对MCF-7细胞有作用,得到MCF-7的谱效方程,经6批药材验证,谱效方程计算值与实际值的偏差率不超过10%。结论 该谱-效方程可用于预测老鹳草的抗乳腺癌作用物质基础。     

基于ITS2 DNA序列的雷公藤属药材资源谱系地理学研究

目的 采用ITS2 DNA条形码技术,研究雷公藤属3种药用植物的遗传特性,揭示其地理分布格局的形成原因。方法 收集雷公藤属植物28个居群223份样本,提取基因组DNA,扩增ITS2基因序列并测序,并进行遗传多样性分析,绘制失配分布曲线检测群居历史动态变化情况,估算雷公藤属种间、种内群体间和群体内的差异及遗传分化系数。结果 雷公藤属28个居群223份样本共检测到12个碱基突变位点,构成10个单倍型。昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum共有7个单倍型,H2～H7为特有单倍型;雷公藤Tripterygium wilfordii共有4个单倍型,H8为特有单倍型;东北雷公藤Tripterygium regelii共有3个单倍型,无特有单倍型;H1为3个物种间的共有单倍型,H9和H10为雷公藤和东北雷公藤共有单倍型。群体遗传多样性分析显示,雷公藤属具有较高的单倍型多态性（H_d＝0.615±0.024）和核苷酸多态性[P_i＝（9.47±0.58）×10⁻³]。群体遗传结构分析显示,雷公藤属的变异主要存在于物种之间（76.14%）,种内群体间和群体内的变异分别为11.42%、12.44%。群体动态历史分析表明,雷公藤属、雷公藤和东北雷公藤曾经历过扩张,而昆明山海棠未经历过扩张。结论 雷公藤属及其属下的昆明山海棠和雷公藤的遗传多样性水平较高,而东北雷公藤遗传多样性水平较低。雷公藤属植物在第4纪冰期时,将中国西南、华中和华东的部分地区作为冰期避难所,冰期后以冰期避难所为中心向四周扩散,形成当前雷公藤属植物的分布格局。     

黄皮树不同部位生长过程中主要生物碱成分的累积研究

目的 分析黄皮树不同生长树龄、不同采收季节、不同采收部位中小檗碱和黄柏碱的质量分数变化规律,为增加中药材种植收益提供依据.方法 采用高效液相色谱分析方法对小檗碱和黄柏碱进行定量测定.结果 黄皮树中小檗碱和黄柏碱的累积高低顺序均为根皮>茎皮>根;2种生物碱的量逐年变化,前3年量变化趋势明显,且第3年的茎皮量接近5%,显示"幼龄黄柏"有开发价值,第3年后2种生物碱量变化趋势减缓;同一树龄10月份采收的黄柏,其黄柏碱和小檗碱较高.结论 小檗碱和黄柏碱代谢累积规律的分析和总结,为黄柏药材采收及资源的可持续利用提供了依据.     

雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆Tw CYP88A1基因。方法:采用c DNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤Tw CYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱。结果:Tw CYP88A1 c DNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 k Da,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点。植物组织表达分析表明Tw CYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低。结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Tw CYP88A1基因全长c DNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础。     

清络通痹方中雷公藤配伍减毒的化学基础研究

目的：通过研究清络通痹方中雷公藤配伍其他药味后,雷公藤中毒性成分雷公藤甲素的溶出规律,从化学角度探索其配伍减毒的物质基础,为雷公藤的临床应用提供实验依据。方法：结合“组分剔除法”、“药味组合法”,采用高效液相色谱法测定清络通痹全方、雷公藤各配伍组合中雷公藤甲素溶出含量。在此基础上,进一步对雷公藤药材、雷公藤单味药、雷公藤配伍三七、雷公藤配伍青风藤进行化学成分的全成分分析,比较雷公藤中雷公藤甲素等成分的溶出变化。结果：在雷公藤投料量相同的情况下,雷公藤甲素溶出的趋势为：全方去三七>全方去青风藤 >全方去地黄 >全方去僵蚕 >全方;青风藤配伍雷公藤 >单味雷公藤 >地黄配伍雷公藤 >僵蚕配伍雷公藤 >三七配伍雷公藤;统计分析表明,三七能明显降低雷公藤甲素溶出（P<0.05）,青风藤能显著增加雷公藤甲素溶出（P<0.05）。全成分分析研究中,雷公藤配伍三七,配伍青风藤后与雷公藤药材及单味药提取物相比,溶出规律与前述结果一致。结论：通过清络通痹方中雷公藤配伍前后化学成分的溶出含量变化可以初步推断,三七配伍雷公藤能降低雷公藤的毒性,而青风藤配伍雷公藤能增强雷公藤的毒性。该研究结果为雷公藤的临床配伍减毒应用提供了实验依据。     

基于UPLC指纹图谱的防己不同部位化学成分差异分析

目的 分析防己根、根茎、茎、叶4个部位UPLC指纹图谱差异,初步获取不同部位之间化学成分类型及部分有效成分含量差异,为合理开发和利用防己药材提供依据。方法 采用UPLC法建立防己不同部位化学指纹图谱;采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）计算不同部位共有峰和相似度,并分析各部位特征峰;利用SPSS 23.0,采用成对样本t检验,对不同样本及不同成分根和根茎间含量差异进行比较。结果 根和根茎化学成分相似度为0.928,两者含化学成分类似,并均含有防己药材指标性成分粉防己碱和防己诺林碱;茎和叶化学成分相似度为0.947,茎、叶与根及根茎相似度均较低,且不含粉防己碱和防己诺林碱。成对样本t检验结果表明,根茎化学成分综合含量高于根中含量,且其差异主要来源于其他非指标性成分,其指标成分粉防己碱和防己诺林碱两者间无显著差异。结论 防己不同部位化学成分类型和含量存在显著差异,根茎中化学成分类型与根相似,且部分成分含量高于根中含量,可作为优质防己药材与根同用;茎和叶中不含防己药材指标性成分粉防己碱和防己诺林碱,不能作为防己药材代替根使用,但其含有许多其他化学成分,可作为新资源用于开发其他药用功效。     

一测多评法同时测定雷公藤药材及制剂雷公藤多苷片中7个质控成分

目的 为提高雷公藤质量控制水平,建立同时测定雷公藤药材及制剂雷公藤多苷片中7个成分的一测多评（quantitative analysis of multi-components with a single-marker,QAMS）方法。方法 采用HPLC法,以雷酚内酯为参照物,计算其它6种成分雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的相对校正因子（f_k/s）,并对f_k/s进行耐用性考察。搜集不同产地、厂家及不同批号的9批雷公藤药材和10批雷公藤多苷片,分别采用外标法和QAMS法测定7个成分含量,比较两者的差异。结果 各个成分的f_k/s重复性良好,对19批样品运用QAMS法和外标法得到的各成分含量无显著性差异（相对平均偏差＜3%）;不同厂家、不同批号及不同产地来源的雷公藤多苷片及雷公藤药材中7个成分含量均存在较大差异,说明应提高雷公藤中药的质量控制标准。结论 所建立的QAMS法准确性高,可用于雷公藤药材及其相关制剂的多成分同时定量分析,为雷公藤中药的全面质量控制提供方法参考。     

雷公藤PTEN基因全长克隆及表达分析

目的获得雷公藤Tripterygium wilfordii磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸肌醇3-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase,PTEN)基因的c DNA全长,并预测其生物学功能。方法根据雷公藤转录组数据设计引物,对雷公藤PTEN(TwPTEN)基因进行全长克隆;通过生物信息学方法对得到的TwPTEN基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果根据分析结果 TwPTEN基因全长为2 247 bp,共编码614个氨基酸,等电点为5.84,相对分子质量为66 900,多重序列比对显示其与其他植物的PTEN基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwPTEN的表达量明显增加,并在12 h达到最高,提示PTEN基因与植物的次生代谢产物的产生有关。结论本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到PTEN基因,为进一步研究TwPTEN基因的功能奠定基础。     

南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析

目的从南方红豆杉Taxus chinensis获得紫杉醇生物合成途径关键酶1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)基因(TcDXS)并进行生物信息学和表达模式分析以及亚细胞定位和功能鉴定。方法采用RACE技术获得TcDXS全长;利用qRT-PCR分析TcDXS在南方红豆杉不同部位的表达情况;采用亚细胞定位分析TcDXS在细胞中的位置;用颜色功能互补实验检测TcDXS功能。结果获得的TcDXS由3 031个核苷酸组成,包含了2 229 bp编码区,编码742个氨基酸,其蛋白相对分子质量为79 400,等电点(p I)为7.99;qRT-PCR检测表明TcDXS在南方红豆杉的嫩叶柄中表达量最高,其次是叶和皮,根和茎中的表达量较低;亚细胞定位结果表明,TcDXS定位在叶绿体中;功能互补实验结果表明,在共同转化p AC-BETA和pTrc-TcDXS的大肠杆菌菌落呈现出橘黄色。结论 TcDXS的克隆和功能分析为深入研究紫杉醇生物合成途径和实现其代谢工程奠定了基础。     

栽培滇龙胆药材不同极性部位紫外吸收光谱特征与判别分析

目的:建立滇龙胆药材不同极性部位的紫外指纹图谱,分析不同栽培模式下药材光谱特征的差异。方法:采用紫外分光光度法检测样品的紫外吸收光谱数据,经过4点平滑和一阶求导对光谱数据进行预处理,建立紫外指纹图谱。运用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法对不同栽培模式下滇龙胆药材的指纹特征及相似性进行评价,通过判别分析评价紫外指纹图谱区分药材栽培模式的能力。结果:不同栽培模式滇龙胆紫外指纹图谱在221~247 nm图谱重叠率低,呈现明显指纹特征;相同栽培模式下,滇龙胆醇提液与水提液紫外指纹图谱有差异,呈现药材不同极性部位的指纹特征。荒坡栽培和龙胆与木瓜间作2种模式下,药材化学成分的光谱特征较接近;荒坡栽培和龙胆与旱冬瓜间作模式下,药材化学成分变化较大,二者光谱特征具明显差别。来自不同栽培模式的滇龙胆样品90%能被正确识别。结论:滇龙胆药材不同极性部位紫外指纹图谱可协助区分药材栽培模式,为不同栽培模式下药材质量的等同性研究提供相关数据信息。