RNA干扰靶向抑制胃癌细胞株SGC7901 hTERT基因表达

背景与目的：胃癌是全人类常见恶性肿瘤之一。在我国，胃癌居各种癌症死亡之首，其总体五年生存率仅15％～20％。在目前尚无有效一级预防措施的情况下，积极探讨有效防治胃癌的方法成为必然趋势。本研究利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi对胃癌细胞增殖的抑制效应。方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入人胃癌细胞系SGC7901细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株。采用real time RT—PCR、MTT和PCR—TRAP法同时检测pGenesil-shRNA—hTERT稳定抑制组和未处理SGC7901细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化。结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SGC7901细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERT mRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制。结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖，是潜在的肿瘤基因治疗新方法。     

靶向hTERT的小干扰RNA诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的机制

[目的]研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的 siRNA诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的分子机制。[方法]化学合成的靶向hTERT的siRNA以脂质体法转染PC3细胞;应用寡核苷酸芯片技术分析细胞凋亡相关基因的转录谱变化;应用Westernblot检测细胞中hTERT、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL、凋亡抑制基因Bcl-2和胞浆Cytc的蛋白水平变化;流式细胞术分析细胞凋亡率变化;比色法测定Caspase-3和Caspase-8的相对活性改变。[结果]靶向hTERT的siRNA能有效抑制hTERT基因表达;转染hTERT-siRNA48h后可引起TRAIL的表达上调,Bcl-2表达下调,Cytc释放增加,Caspase-3活性增强,细胞凋亡率升高。[结论]靶向hTERT的小干扰RNA通过活化线粒体信号传导途径诱导PC3细胞凋亡。     

RNAi沉默人端粒酶逆转录酶对HeLa细胞生长及药物敏感性影响的研究

目的:探讨利用短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达后对人宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响.方法:将构建的hTERT-shRNA真核表达载体用脂质体转染入HeLa细胞中,经G418筛选得到稳定转染的细胞株,并绘制细胞生长曲线.RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测hTERT、c-myc mRNA和蛋白表达.镜下观察干扰组细胞与对照组细胞对化疗药物的反应,并在紫杉醇给药后采用流式细胞术和细胞免疫化学的方法分别检测两组细胞的死亡率和细胞内微管组织状态.结果:干扰组细胞在6代以后hTERT的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组,P<0.05,n=3,而c-myc的表达以及细胞的生长速度与对照组差异无统计学意义,P>0.05, n=3.干扰组细胞对化疗药物紫杉醇的反应明显不同于对照组,紫杉醇给药后干扰组细胞的死亡率(9.7%)高于对照组细胞(6.4%),但给药前后两组细胞内微管的分布差异无统计学意义,P>0.05, n=3.结论:单独下调HeLa细胞中hTERT的表达不能降低肿瘤细胞的生长速度,也不能显著改变c-myc的表达,却可以增加细胞对紫杉醇的敏感性,而hTERT是否参与微管的调节有待进一步探讨.     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性siRNA对乳腺癌细胞hTERT水平及细胞生长影响的研究

背景与目的:在肿瘤细胞中端粒酶高水平的表达是肿瘤细胞永生化的重要因素。本研究利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)特异性地抑制乳腺癌细胞的hTERT,通过研究该效应对细胞生长、凋亡和永生化相关基因的影响,来进一步阐述端粒酶在肿瘤细胞永生化可能的作用。方法:通过实时定量RT-PCR(Real-TimeRT-PCR)测定各乳腺癌细胞系中内源性hTERT的表达水平及测定RNA干扰对与细胞永生化相关基因的调节;通过脂质体转染法将hTERTsiRNA导入MCF7细胞;通过细胞生长曲线和流式细胞仪(FACS)评价该特异性的siRNA所诱导的hTERT水平下调对细胞生长和凋亡的影响。结果:所检测的乳腺癌细胞系中,hTERT均相对高表达。hTERTsiRNA可抑制MCF7中hTERT的水平,并在抑制后的第4天开始表现出显著的细胞生长抑制,并出现凋亡,以及多个细胞永生化相关的基因,如RAC1、PCYT2、FDFT1和ATP5G2,表达水平均下调50%以上。结论:hTERTsiRNA可特异性地抑制hTERTmRNA水平,从而抑制细胞生长,导致细胞凋亡,并下调多个细胞永生化基因。     

人端粒酶逆转录酶siRNA诱导宫颈鳞癌耐药细胞株SiHa/DDP凋亡的分子机制研究

目的研究人端粒酶逆转录酶siRNA(h TERT SiRNA)诱导宫颈鳞癌耐药细胞株Si Ha/DDP凋亡的可能机制。方法每毫升培养液中加顺铂2μg常规培养Si Ha/DDP细胞,实验分为4组,空白对照组(A组):仅用细胞培养液培养的Si Ha/DDP组;脂质体对照组(B组):仅添加转染试剂的Si Ha/DDP组;不针对任何基因的Negative Control siRNA对照组(C组);转染组(D组):h TERT SiRNA与脂质体混合液转染Si Ha/DDP细胞。按要求转染细胞后常规培养,于转染后24 h、48 h、72 h分别收集各组细胞进行相关检测,各组均应用实时荧光定量技术检测细胞h TERT mRNA表达、应用Annexin-V/PI双染流式细胞术检测Si Ha/DDP细胞凋亡率、应用MTT法检测h TERT SiRNA转染后Si Ha/DDP细胞增殖情况。结果 1转染后24 h、48 h、72 h各组细胞相对A组的TERT mRNA含量分别为:D组(0.249±0.019)、(0.138±0.009)、(0.174±0.016);C组(0.931±0.036)、(0.940±0.025)、(0.901±0.042);B组(0.956±0.052)、(0.961±0.037)、(0.943±0.28);各时间点siRNA-1组h TERT mRNA相对表达量与各对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2转染后SiRNA-1组早期细胞凋亡率[(86.48±7.25)%]明显高于C组[(0.11±0.08)%]、B组[(5.23±1.22)%]和A组[(0.09±0.08)%],差异有统计学意义(P<0.05)。3转染后各时间点各组细胞OD490值比较差异有显著统计学意义(P<0.01),生长曲线显示SiRNA-1组慢于对照组。结论 h TERT siRNA转染Si Ha/DDP细胞可降低h TERT mRNA表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡。     

RNA干扰hTERT基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

目的:探讨RNA干扰hTERT(人端粒酶逆转录酶)基因对人喉鳞状细胞癌的治疗作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.将shRNA质粒分别转染人喉癌Hep-2细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在Hep-2细胞及瘤体内的表达;以MTT法观察质粒对Hep-2细胞增殖的抑制作用;以蛋白印迹法(Western blot法)检测Hep-2细胞中hTERT蛋白的表达;以免疫组化SP法检测裸鼠瘤体内hTERT蛋白的表达.结果:pshRNA1、pshRNA2转染Hep-2细胞及pshRNA1转染瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光,hTERT蛋白表达明显下降.细胞受pshRNA1、pshRNA2转染后,其生长活性受到明显抑制.体内抑瘤实验表明,与空质粒载体组(pshRNA4)和生理盐水组相比,pshRNA1组移植瘤生长明显受到抑制.结论:表达shRNA的、hTERT基因特异的真核表达质粒能有效转染体内、外喉鳞癌细胞,并可有效抑制人喉鳞癌细胞的生长,为今后应用RNA干扰基因治疗喉癌提供重要的实验参考.     

hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Raji细胞凋亡的影响

目的利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Raji细胞端粒酶活性后,探讨顺铂对Raji细胞凋亡的影响.方法采用苔盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与顺铂联合作用对Raji细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪分析细胞凋亡.结果hTERT ASODN作用于Raji细胞24 h再加入顺铂,对细胞抑制明显增强(P＜0.05).加入顺铂作用后48 h,细胞出现典型的凋亡形态学改变,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带.凋亡细胞百分率(25.24±1.58)%,与正义寡核苷酸与顺铂联合作用组、单用顺铂作用组比较有显著性差异(P＜0.01).结论hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Raji细胞凋亡.     

双基因干扰对MCF-7细胞基因表达抑制及细胞凋亡影响的研究

背景与目的：肿瘤细胞具有端粒酶高表达及端粒稳定性强两大特点。人端粒酶逆转录酶（hTERT@是端粒酶的催化亚单位,端粒重复序列结合因子2（TRF2@对维持端粒长度及端粒稳定性非常重要。本实验研究针对hTERT和TRF2的特异性RNAi腺病毒表达载体单独和联合转染乳腺癌MCF-7细胞后,对两基因的抑制效率以及对细胞凋亡的影响,探索针对端粒的多基因干扰对乳腺癌基因治疗的可行性。方法：构建RNA干扰腺病毒载体rAd-hTERT和rAd-TRF2,单独和联合转染MCF-7细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和TRF2基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果：①转染后48h,与PBS组相比,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约86%,对TRF2基因表达无明显抑制（P〉0.05@;rAd-TRF2对TRF2基因mRNA的抑制率约80%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05@;rAd-hTERT/rAd-TRF2联合干扰组对hTERT基因表达抑制率约88%,TRF2基因表达抑制率约85%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT和TRF2基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05@。②干扰组转染后1～6d均能促进细胞凋亡。单基因干扰组转染后3～5d凋亡最明显,第5天达凋亡高峰;凋亡率rAd-hTERT组为46.2%,rAd-TRF2组为43.5%。联合组转染后第1天凋亡率为46.2%,第2天为68.5%,第3～6天均维持在较高水平,第6天达77.6%。转染后1～6d,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05@。结论：①rAd-hTERT和rAd-TRF2转染MCF-7细胞48h后可分别显著抑制hTERT和TRF2基因mRNA表达,但rAd-hTERT和rAd-TRF2在抑制hTERT和TRF2基因mRNA表达上无相互协同或相互抑制作用。②rAd-hTERT和rAd-TRF2均能有效促进MCF-7细胞凋亡,且两者联合干扰效果具有累加效应。因此利用联合干扰技术靶向抑制端粒酶活性和端粒稳定性相关的多基因的表达能更高效地促进乳腺癌细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖与生长。     

shRNA-targeted hTERT suppress cell proliferation of bladder cancer by inhibiting telomerase activity

RNA interference (RNAi) has demonstrated profound prospect in human gene research. hTERT, the rate-limiting component of telomerase activity, is highly expressed in bladder cancer cells. Here, we investigated the anti-proliferation effects of small hairpin interfering RNA (shRNA)-targeted hTERT gene on bladder cancer in vitro and in vivo. The results showed that ph2-shRNA, the most-effective vector carrying shRNA-targeted hTERT, could significantly inhibit the cell proliferation by down-regulating hTERT expression, decreasing telomerase activity, decreasing cell number of S phase, increasing the cell number of G0/G1 phase in T24 cells and xenograft tumor tissues, and attenuate the tumor growth of xenograft mice model compared with controls. Our results demonstrate that hTERT-directed shRNAs are potent inhibitors of bladder cancer. Lin Zou and Penghui Zhang were equally contributed to this paper.     

RNA干扰survivin基因对卵巢癌细胞生长凋亡及药物敏感性的影响

目的 探讨下调survivin基因对卵巢癌顺铂(DDP)耐药细胞株SKOV3/DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的影响.方法 构建survivin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSilencer-survivin,用脂质体方法转染SKOV3/DDP细胞株,另设未转染组和转染pSilencer-control组作为对照.显微镜下观察转染前后细胞的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测survivinmRNA及蛋白的表达,二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化.各组细胞加入DDP,检测其对DDP药物敏感性的影响.结果 survivin siRNA可明显下调SKOV3/DDP细胞中survivin mRNA及蛋白表达水平.SKOV3/DDP细胞生长受到明显抑制,生长曲线低平.转染48 h后,转染pSilencer-survivin组细胞凋亡率为19.1%,明显高于末转染组(2.6%)和转染pSilencer-control组(3.5%),G1/G0期细胞所占的比例增高,而G2/M期细胞所占的比例降低.转染pSilencer-survivin组细胞的IC50明显降低,为1.16 μg/mi.结论 survivin siRNA可下调SKOV3/DDP细胞中survivin的表达,使细胞生长减慢,凋亡增加,对DDP的药物敏感性增强.     

RNA干扰抑制Hep-2细胞人端粒酶逆转录酶基因表达对放射敏感性的影响

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,观察其联合射线对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性和细胞存活的影响,研究hTERT基因在放射增敏中的作用。方法根据hTERT mRNA编码序列设计RNA干扰(RNAi)靶点,构建重组表达质粒pshRNA-hTERT,构建成功后,转染Hep-2细胞并作射线处理,用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR- EHSA)检测端粒酶活性的动态变化,采用克隆形成分析方法观察质粒pshRNA-hTERT对Hep-2细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比SER_(SF2)。结果转染质粒pshRNA-hTERT后,Hep-2细胞的hTERT mRNA表达抑制率为60.8%,质粒pshRNA-hTERT不仅能够抑制Hep-2细胞的端粒酶活性(P<0.05),而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(P<0.05)。照射前经pshRNA-hTERT处理24h,明显降低了2Gy照射后Hep-2细胞的存活分数(85.7%),与单纯放射组(67.7%)相比,差异有统计学意义(P<0.05),pshRNA-hTERT的放射增敏比SER~(SF2)为1.27。结论RNAi显著抑制了靶基因hTERT的表达,质粒pshRNA-hTERT能明显抑制2Gy照射诱导的Hep-2细胞端粒酶活性升高,并显著提高其体外放射敏感性;质粒pshRNA-hTERT的放射增敏作用可能与端粒酶活性受抑制有关。     

同时抑制VEGF、hTERT和Bcl-xl表达对喉癌细胞生长增殖的影响

 目的 研究同时抑制VEGF、hTERT和Bcl-xl的表达对体内、外喉癌细胞生长增殖的影响。 方法 使用针对VEGF、hTERT和Bcl-xl mRNA的shRNA真核表达载体：pshRNA-VEGF-hTERT-Bcl-xl。通过脂质体的介导将该质粒转染至体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞。四甲基偶氮唑蓝(MTT) 检测该质粒对Hep-2细胞的毒性作用;构建喉鳞癌荷瘤裸鼠动物模型,采用瘤体内多点注射的方式将质粒导入瘤体内,观察质粒对移植瘤的生长抑制作用。 结果 质粒pshRNA-VEGF-hTERT-Bcl-xl成功转染到喉癌细胞中并表达。经质粒pshRNA-VEGF- hTERT-Bcl-xl处理后,MTT结果显示癌细胞增殖能力显著下降,与0.9%氯化钠溶液治疗的对照组比较,在处理后24h、48h和72h,细胞增殖活性分别降至62.22%,28.77%和10.24%。pshRNA-VEGF-hTERT-Bcl-xl质粒治疗组裸鼠移植瘤生长缓慢,体积明显小于对照组,首次治疗后28天抑瘤率为90.2％,与0.9%氯化钠溶液治疗的对照组比较,P<0.01。 结论 同时抑制VEGF、hTERT、Bcl-xl表达可显著提高喉鳞癌的治疗效果。该实验为多基因靶向的肿瘤基因治疗提供了新思路。     

EGFR在RNAi-hTERT抑制HeLa细胞增殖过程中的作用研究

目的探讨EGFR在靶向hTERT的RNA干扰抑制HeLa细胞增殖过程中的作用。方法以HeLa细胞为实验细胞,将实验分为6组:A组未处理;B组转染试剂;C组转染空载体;D组转染阴性siRNA;E组转染siRNA-hTERT;F组同时转染pcDNA3.1-EGFR和siRNA-hTERT。转染48 h后,应用Western Blot法检测各组HeLa细胞的hTERT与EG-FR蛋白表达水平,MTT法分析各组转染24、48、72和96 h后4个时间点的细胞增殖抑制率。结果转染48 h后的3个时间点,E组细胞增殖抑制率显著高于C、D和F组(P<0.01、0.01、0.01),同时伴有EGFR蛋白表达水平显著降低;而F组EGFR蛋白表达水平恢复,细胞增殖抑制率未见升高。结论靶向hTERT的RNA干扰抑制HeLa细胞增殖,可能依赖于EGFR蛋白水平的下调。     

siRNA靶向抑制RPL6基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制核糖体蛋白L6（RPL6）基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响。方法 优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制RPL6基因的siRNA载体片段（siRPL6-1、siRPL6-2）分别高效转染人宫颈癌HeLa细胞（抑制组）,同时设转染无义序列（siControl）的空转染组及不进行任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测RPL6表达水平以筛选抑制率高的siRPL6载体用于后续实验。噻唑蓝比色（MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况, Western blotting检测各组转染96 h后的cyclin A、CDK2和p21CIP1表达情况。结果 抑制组的RPL6 mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,siRPL6-2片段的干扰效率高于siRPL6-1,故后续实验选择siRPL6-2片段;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G0／G1期细胞比例升高,但S期和G2／M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制组转染后的p21CIP1水平升高,cyclin A和CDK2 水平降低,与空转染组和对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。空转染组和对照组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过siRNA抑制RPL6基因表达可抑制增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对宫颈癌防治有一定价值。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

Livin靶向siRNA诱导大肠癌细胞调亡的作用

Objective:To construct siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene and observe the apoptosis induction effecl of it in human colon cancer cells.Methods:SiRNA recombinant expression vector targeting Livin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell.The effect of siRNA recombinant expression vector was detected by RT-PCR,Westem blot,MTT reduction assay and flow cytometry.Results:It was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis that siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene was constructed successfully.Inhibition ratio of Livin siRNA at mRNA and protein levels were 30.18% and 28.88%.The growth of cancer cells was inhibited significantly and the apoptotic ratio was 13.36±1.45%.Conclusion:The siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene has been constructed successfully.It not only can inhibit the expression of Livin gene but also can induce apoptosis in human colon cancer cells remarkably.