反义C—myc寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC—7721的生长抑制

针对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ第二外显子起始妈ＡＵＧ及下游４个密码子设计合成了反义、正义及锚配寡核苷酸（ＯＤＮｓ）、并对合成的ＯＤＮｓ进行 硫代磷酸化修饰。在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１培养体系中，对反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）抑制细胞增殖的作用进行了研究。发现（１）与正义和错配ＯＤＮｓ相比较，反义Ｃ－ｍｙｃＯＤＮ有明显抑制人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１生长的作用；（２）该生长抑制作用随ＡＳＯＤＮ剂量增加而增     

反义寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖

目的 证实反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的效应。方法 人工合成正义、反义及错配反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸,转入体外培养的ＶＳＭＣ中,分别于作用后１～５ｄ进行细胞计数和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定。结果加入反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸的ＶＳＭＣ增殖受到抑制,崦正义和错配反义寡核苷酸对ＶＳＭＣ增殖没有明显影响。结论 反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸可有效阻遏     

反义c-myc、增殖细胞核抗原基因片断抑制血管平滑肌细胞相关基因表达

目的研究有效的防治血管术后再狭窄的方法，以及应用反义ｃｍｙｃ、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因片断来封闭其相应基因表达的可行性。方法设计并合成ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ正义、反义及四个碱基错配的反义寡核苷酸，经体外稳定性检测和细胞转染实验证实其有效性后，分别作用于体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），应用逆转录ＰＣＲ半定量测定及计算机图像分析的方法，观测其对ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ基因表达的影响。结果设计合成的寡核苷酸在血清培养基中１～５天未被完全降解；寡核苷酸能顺利进入ＶＳＭＣｓ内；１０μｍｏｌ／Ｌ浓度的反义ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ作用于ＶＳＭＣｓ后１～５天，其相应的ｃｍｙｃ和ＰＣＮＡ基因表达减弱，计算机图像分析表明其表达产物与对照组相比差异有显著意义（Ｐ＜０．０５），而正义和错配反义寡核苷酸无此效应（Ｐ＞０．０５）。结论反义ｃｍｙｃ和ＰＣＮＡ寡核苷酸可通过抑制其相应基因表达来实现阻遏血管平滑肌细胞增殖     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响

目的观察大鼠腹主动脉损伤后内膜增生的影响,为采用反义ｃｍｙｃ战略防治再狭窄的早期临床试验奠定基础。方法将反义ｃｍｙｃ反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）通过ｐｌｕｒｏｎｉｃｇｅｌ缓释系统和Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染导入系统,将其作用于大鼠腹主动脉损伤后的血管外膜,饲养三周后,处死动物,对所取的血管节段进行组织切片和弹力纤维染色,在显微镜下进行形态观察和采用图像分析系统进行图像分析,计算出内膜／中膜（Ｉ／Ｍ）面积之比和Ｉ／Ｍ厚度之比,并进行统计学分析。结果通过形态观察和Ｉ／Ｍ面积和Ｉ／Ｍ厚度之比,发现反义ｃｍｙｃＯＤＮ明显抑制了内膜增生,而且随着反义ｃｍｙｃＯＤＮ剂量的增加,其对内膜增生的抑制作用更加明显,而正义ｃｍｙｃＯＤＮ和错配ｃｍｙｃＯＤＮ与对照组相比,对内膜增生无影响。结论反义ｃｍｙｃＯＤＮ以剂量依赖性和序列特异性方式抑制了新生内膜的形成。为采用反义ｃｍｙｃ途径防治再狭窄的早期临床试验奠定了基础     

反义寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞c-myc, PCNA基因的表达

目的：利用反义寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞基因表达,为移植血管再狭窄的基因治疗提供理论依据。方法：人工合成正义,反义及错配反应ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ基因片断,并转入体外培养的ＶＳＭＣ中,运用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）测定细胞中相应基因表达的情况。结果：反义寡核苷酸能有效抑制ＶＳＭ中ｃ－ｍｙｃ,ＰＣ－ＮＡ基因的表达,而正义和错配反应寡核苷酸没有此效应。结论：反应寡核苷酸能阻遏ＶＳＭＣ中相应基因     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

为研究硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(ODN)对血管平滑肌细胞(SMC)的增殖、迁移及凋亡的影响。应用脂质体分别介导硫代磷酸修饰的反义c-mycODN、正义c-mycODN和错配c-mycODN进入体外培养的大鼠主动脉SMC内,观察其对SMC细胞c-myc表达、增殖、迁移和凋亡的影响。结果:①反义ODN降低c-myc蛋白的表达。②反义c-mycODN抑制SMC增殖、迁移,并诱导SMC凋亡。而正义ODN及错配ODN则无上述作用。结果提示:应用反义技术抑制c-myc表达在防治经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)术后再狭窄中具有潜在作用。     

c-myc反义寡核苷酸对低氧内皮细胞条件培养液诱导的肺血管周细胞增殖的影响

应用细胞培养、核酸斑点杂交、~３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（~３Ｈ－ＴｄＲ）掺入、免疫细胞化学、图像分析等技术观察ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对低氧内皮细胞条件培养液（ＨＥＣＣＭ）诱导的大鼠肺血管周细胞ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达及~３Ｈ－ＴｄＲ掺入量的影响。结果表明,ＨＥＣＣＭ显著促进周细胞 ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、ＰＣＮＡ表达（Ｐ＜０．０１）及~３Ｈ－ＴｄＲ掺入量增加（Ｐ＜０．０１）,反义ＯＤＮｓ显著阻抑 ＨＥＣＣＭ诱导的周细胞ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、ＰＣＮＡ表达（Ｐ＜０．０１）及~３Ｈ－ＴｄＲ掺入量增加（Ｐ＜０．０５）,而同义ＯＤＮｓ无上述作用（Ｐ＞０．０５）。结果提示,ＨＥＣＣＭ可通过上调ｃ－ｍｙｃ基因表达促进肺血管周细胞增殖,反义ＯＤＮｓ通过下凋ｃ－ｍｙｃ基因表达,抑制ＨＥＣＣＭ诱导的肺血管周细胞增殖。     

反义myb寡核苷酸对内皮素诱导动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

合成反义和正义ｃ－ｍｙｂ１８－ｍｅｒ，分别导入培养的ＷＫＹ主动脉平滑细胞（ＳＭＣｓ），同时用内皮素诱导ＳＭＣｓ增殖。反义ｃ－ｍｙｂ寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对内皮素诱导ＳＭＣｓ的抗细胞增殖抑制作用随浓度（６０μｍｏｌ·Ｌ－１～１２０μｍｏｌ·Ｌ－１）的增加而增加。用１２０μｍｏｌ·Ｌ－１反义ＯＤＮＳ抗细胞增殖能力随时间延长而下降。免疫组化显示受抑制细胞ｍｙｂ水平较同期对照组或正义ＯＤＮｓ组低。以上为反义ＯＤＮｓ抑制外源性生长因子或细胞因子诱导靶基因的高表达和细胞增殖提供了新的线索，同时为探讨癌基因表达调控与动脉ＳＭＣｓ增殖的关系提供了一种新方法。     

慢性阻塞性肺病患者肺内细胞增殖与凋亡的研究

目的研究细胞增殖、凋亡及其调节基因在慢性阻塞性肺病（ＣＯＰＤ）继发肺动脉高压中的作用。方法应用免疫组化及原位缺口末端ＤＮＡ碎片标记技术检测ＣＯＰＤ患者肺内细胞增殖及凋亡,并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ＣＯＰＤ患者肺内ｃｍｙｃ、ｂｃｌ２及ｐ５３基因表达。结果ＣＯＰＤ患者及对照组肺内（包括肺小血管壁）均存在着一定比率的增殖及凋亡细胞。两组相比,ＣＯＰＤ组增殖指数增高而凋亡指数减少,增殖与凋亡比值显著增高,约为对照组４倍。在ＣＯＰＤ患者肺内,增殖细胞绝大部分位于肺小血管壁,而凋亡细胞在肺小血管壁上较对照组少见。ｃｍｙｃ、ｂｃｌ２及蛋白表达在ＣＯＰＤ肺内比对照组明显增高,主要在肺小血管壁。ｃｍｙｃｍＲＮＡ表达量约为对照组３倍,ｂｃｌ２ｍＲＮＡ三条带表达量约为对照组２５～３５倍,ｐ５３基因ｍＲＮＡ表达量比对照组显著减少,约为１／３倍。结论可能由于ｃｍｙｃ、ｂｃｌ２及ｐ５３基因异常表达所致的细胞增殖与凋亡异常参与了ＣＯＰＤ时的肺血管结构改建的调节,亦即参与了ＣＯＰＤ继发的肺动脉高压过程     

ODC反义寡核苷酸对K562细胞凋亡及分化和相关基因表达的影响

目的：观察鸟氨酸脱羧酶反义寡核苷酸（ＯＤＣａｓＯＤＮ）引起鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）表达及活性的抑制对人红白血病Ｋ５６２细胞生长、凋亡的影响,为探索抑制多胺生物合成的抗癌新途径提供实验依据。方法：采用硫代修饰的ＯＤＣａｓＯＤＮ处理细胞,观察生长曲线,及用Ｇｉｅｍｓａ染色观察形态变化,ＲＮＡ斑点杂交检测基因表达,放射微量法测定ＯＤＣ活性。结果：ＯＤＣａｓＯＤＮ能抑制Ｋ５６２细胞生长、诱导凋亡,并证明了该细胞的ＯＤＣ、Ｂｃｌ２表达下降及ＯＤＣ活性受到抑制。结论：ＯＤＣａｓＯＤＮ能下调ＯＤＣ表达、降低其酶活性,引起ｂｃｌ２基因表达抑制,导致Ｋ５６２细胞生长抑制及凋亡诱导。     

人白细胞相关抗原B27及细菌多肽在脊柱关节病发病中的作用

目的了解细菌多肽应具备什么基本条件才能被人白细胞相关抗原（ＨＬＡ）Ｂ２７递呈而导致脊柱关节病。方法以来自衣原体热休克蛋白６０、能与Ｂ２７分子结合的９肽作为原型，用人工方法将９肽的每一个氨基酸残基均以另外１９种氨基酸替换，将合成的１８０种９肽分别与Ｂ２７Ｔ２细胞孵育，观察其与抗Ｂ２７单克隆抗体Ｂ２７Ｍ２的反应性。结果与Ｂ２７分子结合的９肽其第２位氨基酸残基应是精氨酸，以其它１９种氨基酸替换均使Ｂ２７Ｍ２的反应性明显降低；第６，８，９位氨基酸残基的选择性亦较高，仅有６～８种氨基酸能诱导与Ｂ２７Ｍ２的反应性；第３，５，７位氨基酸残基没有什么选择性，几乎任何一种氨基酸残基对Ｂ２７Ｍ２反应性的影响均不大。结论第２，９位氨基酸残基是９肽与Ｂ２７紧密结合所必需的，而第６，８位氨基酸可能与抗Ｂ２７单克隆抗体的识别有密切关系     

胰岛素对血管平滑肌细胞增殖及原癌基因c－fos，c－myc异常表达的实验研究

我们观察了不同浓度的胰岛素对体外培养人血管平滑肌细胞增殖的影响，及其该过程中原癌基因ｃ－ｆｏｓ，ｃ－ｍｙｃ的表达。结果表明，胰岛素能促进血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖，即：ＳＭＣ数目的增多，ＳＭＣＤＮＡ的合成；胰岛素能促进原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ的异常表达；且以上作用均存在着剂量－效应关系。这些结果提示，高胰岛素血症促进动脉粥样硬化（ＡＳ）发生、发展可能是通过促进某些原癌基因异常表达，进而促进ＳＭＣ增殖而实现的。这也许是某些基因治疗ＡＳ的基础。     

反义核苷酸对宫颈癌细胞恶性增殖的逆转作用

目的　探讨反义硫代寡核苷酸对 HPV16阳性人宫颈癌细胞恶性增殖的影响 .方法　人工合成 3段 18- mer的反义硫代寡聚脱氧核苷酸 AS- ODN1 - 3.其中 ,AS- ODN1(AE6 ) ,AS- ODN2 (AE7)分别与 HPV16 E6 ,E7开放读框起始码及其侧翼序列互补 ,AS- ODN3为一随机序列 .分别用 3种反义寡核苷酸处理整合有 HPV16基因组的宫颈癌细胞 Si-Ha.通过生长曲线测定、3H- Td R参入试验及软琼脂克隆形成试验 ,观察反义寡核苷酸对 Si Ha细胞恶性增殖的影响 .结果　 AE6及 AE7均抑制了 Si Ha细胞的生长速率和 DNA合成 ,但对 HPV16阴性的人宫颈癌细胞 He L a无明显影响 ;经 AE6及 AE7处理后的 Si Ha细胞在软琼脂上克隆形成数减少 ;随机序列对 Si Ha细胞增殖无抑制作用 .结论　通过特异性抑制 E6 ,E7基因的表达 ,反义寡核苷酸对 HPV16阳性宫颈癌细胞恶性增殖有显著抑制作用 .     

重组反义c-myc腺病毒诱导HL-60 细胞分化的作用

目的研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)对人急性早幼粒HL-60细胞系的诱导分化作用及分子机制,探讨Ad-AS-c-myc用于急性早幼粒白血病基因治疗的可能性.方法采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合多聚阳离子转染HL-60细胞,X-gal染色判断转染效率.采用形态学、MTT试验、RT-PCR、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究.结果多聚阳离子可提高腺病毒对HL-60细胞的转染,Ad-LacZ protamine sulfate转染率达79.8%.Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞c-myc基因在转录及蛋白水平的表达.Ad-AS-c-myc抑制HL-60细胞生长及活力(抑制率51%),降低其核浆比例,增加其过氧化酶活性,引起其G0/G1阻滞及分化相关基因c-fos基因表达增强.结论Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有抑制生长及诱导分化作用.其生物学作用与HL-60细胞过氧化酶活性及c-fos的表达有关.Ad-AS-c-myc在急性早幼粒白血病基因治疗中具有潜在的临床价值.     

Bcl-2、c-myc与胃癌细胞凋亡的关系

目的：探讨癌基因Ｂｃｌ ２、ｃ ｍｙｃ对细胞凋亡的影响。方法：用免疫组化ＬＳＡＢ法检测两者在６０例胃癌中的表达，并在光镜下对受检组织ＨＥ片进行凋亡细胞计数。结果：Ｂｃｌ ２、阳性胃癌的细胞凋亡指数明显低于阴性胃癌（０４１±０２９比０．８６±０．５１，Ｐ＜００５），ｃ ｍｙｃ阳性组织较阴性组织有更高的凋亡指数（０７１±０．３１比０．３２±０．２０，Ｐ＜００５）。结论：Ｂｃｌ ２与ｃ ｍｙｃ对胃癌细胞凋亡有相反的调控作用。     

Effects of Antisense Oligodeoxynucleotide to Follicle-stimulating Hormone Receptor on the Cell Proliferation and Apoptosis in Cells Derived from Human Ovarian Mucinous Cystadenocarcinoma in Vitro

The human ovarian mucinous cystadenocarcinoma (hOMC) cells were co-cultured with antisense oligodeoxynucleotide (antisense ODN), nonsense ODN, and follicle-stimulating hormone (FSH) at different concentrations for the purpose of observing the effects of antisense ODN to FSH receptor (FSHR) on the proliferation and apoptosis of cultured hOMC cells in vitro. The inhibitory rates of growth were measured by using MTT method on the 2nd, 4th, 6th, 8th and 10th days after the interference of antisense ODN, nonsense ODN, and FSH, respectively. The apoptotic rates and the cell cycles were determined by means of flow cytometry, the apoptosis indexes were detected by us-ing TUNEL, and the expression of caspase-3 was measured by using SP immunohistochemistry. Compared with that in the control group, the proliferative activity of hOMC cells was increased ob-viously in FSH groups (P<0.05 or P<0.01), decreased distinctly in antisense ODN groups (P<0.05 or P<0.01), and unchanged in nonsense ODN groups, respectively. Meanwhile, antisense ODN could significantly antagonize the FSH-promoted cell proliferative activity (P<0.01). Compared with those in the control group, the apoptotic rates and the expression of caspase-3 were dramatically increased in the mid- and high-dose antisense ODN groups (P<0.05 or P<0.01), while the number of cells in G1/G0 phase was significantly decreased and that in S phase distinctly increased (P<0.01). There was no change in nonsense ODN groups (P>0.05). It was suggested that FSH may improve the develop-ment of hOMC cells. However, antisense ODN could inhibit proliferative activity and the FSH-promoted proliferative activity in hOMC cells, at the same time, antisense ODN could inhibit hOMC cell growth by inducing apoptosis.     

Effect of C-myc antisense oligodeoxynucleotides on hypoxia-induced proliferation of pulmonary vascular pericytes

Muscularization of non- muscular arterioles ofintra- acinar pulmonary arteries is an important mor-phological feature of pulmonary vascular structuralremodeling( PVSR) during the development of hy-poxic pulmonary hypertension.Recent studies sug-gest that hypoxia could induce pericytes proliferationand differentiation into smooth muscle cell- like cells,which results in muscularization of non- muscular ar-terioles of the lung[1,2 ] . However,the mechanism ofhypoxia- induced proliferation of pe…     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。