人骨髓间充质干细胞中Toll样受体的表达特征

本研究探讨健康供体骨髓源性间充质干细胞（BM—MSC）中Toll样受体（TLR）的表达特征,,用Ficoll法分离培养健康供体的BM—MSC;流式细胞术（FCM）检测BM—MSC中CD34、CD45、HLA—DR、CD44和CD71的表达;免疫细胞化学法检测爬片BM—MSC细胞中CD71的表达;应用茜素红染色和油红染色检测BM—MSC细胞成骨及成脂诱导情况;半定量RT—PCR法检测TLR1—10mRNA的表达。结果表明,体外分离培养的BM—MSC中CD34、CD45和HLA—DR表达呈阴性．CD44和CD71表达呈阳性;爬片BM-MSC细胞中CD71的表达呈阳性。BM—MSC经成骨和成脂诱导后出现钙沉积和脂滴,茜素红染色和油红染色均呈阳性。BM—MSC中TLR1—10mRNA均有表达,其中TLR2、TLR3、TLR4、TI,R7、TLR8、TLR9均高表达,TLR1、TLR5、TLR6、TLR10均低表达。结论：从健康供体骨髓中分离培养的BM—MSC表达不同水平的TLR1-10111RNA。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点.目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供.方法:采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验.流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化.通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定.主要观察指标:①细胞形态.②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期.③表面标志物的鉴定.④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况.结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P＜0.05).两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P＜0.05).②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P＜0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P＜0.05).③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P＜0.05).结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用.     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为类许旺细胞的初步研究

目的：探索将兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）在体外定向诱导分化为类许旺细胞（Schwann Cells，SC）有效的诱导方法。方法：（1）中国白兔5只，穿刺抽取股骨大转子骨髓3mL，用密度为1．073g／mL的percoll淋巴分离液行密度梯度分离，吸取中间白色膜状细胞层，接种在加有10％FCS的DMEM培养液的塑料培养瓶中，观察细胞形态并传代。（2）MSCs传至第3代，实验组加入加有0．5mmol β-巯基乙醇、20ng／mL全反式黄酸、2．5μmol Forskolin、5ng／mL bFGF、20ng／mL PDGF、100ng／mL HRG的培养液培养24h，然后换用10％FBS的DMEM培养液培养24h，同样方法再诱导一次。对照组不加诱导剂，用10％FCS的DMEM培养液培养。观察两组MSCs的细胞形态，7d后用抗S-100、GFAP和P75抗体做免疫组织化学染色来鉴定诱导后MSCs。结果：MSCs在体外培养以梭形细胞为主，细胞平行排列或旋涡状生长，胞浆丰富，核大，核染色质细，有些核仁明显。细胞经多次传代后，呈长梭型。加入诱导剂后有少量细胞死亡，诱导后的细胞免疫组化阳性。诱导后细胞S-100、GFAP、P75免疫组化染色阳性率分别为74.9％、83％、70％。结论：兔MSCs可以在体外培养、增殖，并经β-巯基乙醇、全反式黄酸、Forskolin、bFGF、PDGF、HRG联合诱导分化为类SC。     

羊水、脐带和骨髓来源间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的：比较羊水来源间充质干细胞（ AF-MSC）、脐带来源间充质干细胞（ UC-MSC）和骨髓来源间充质干细胞（ BM-MSC）对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法从妊娠中期羊水、新生儿脱落脐带、正常成人骨髓中分离获取原代AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC。观察形态并采用流式细胞术检测表面分子。取传代培养的第3代的AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC体外诱导培养后,观察体外诱导成骨成脂多向分化情况。将不同细胞浓度的AF-MSC, UC-MSC和 BM-MSC分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较3种不同来源的MSC对淋巴细胞增殖的调控作用。结果分离培养的AF-MSC, UC-MSC和BM-MSC分别表达MSC特异性表面分子CD29、CD70、 CD90,不表达造血干细胞表面分子CD45。体外传代培养的AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC对淋巴细胞增殖的抑制中,当淋巴细胞∶MSC为1∶1、1∶10、1∶50、1∶100时,对淋巴细胞增殖的抑制率AF-MSC最强, BM-MSC最弱。结论 AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC均具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,其中以AF-MSC抑制效果最强, BM-MSC最弱,其抑制效果与MSC数量有关。     

人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究

为了对比人脐带组织源间充质干细胞（UC-MSC）与骨髓源间充质干细胞（BM-MSC）的生物学特性,从足月胎儿脐带组织和成人骨髓中分离出间充质干细胞（MSC）。用有限稀释法、流式细胞术、倒置显微镜检及RT-PCR等方法检测UC-MSC和BM-MSC的分离成功率、细胞产量、成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、增殖特性、免疫表型和多向诱导分化能力等并对比性研究二者的生物学特性。结果表明,UC-MSC和BM-MSC的分离成功率均达100%;虽然由脐带组织中分离的有核细胞数低于骨髓（1×10^6/cmvs5.5×10^7/ml）（p=0.0002）,但在培养第14天由脐带和骨髓中得到的贴壁细胞数无差异（8.6×10^5/cmvs8.4×10^5/ml）（p〉0.05）;UC-MSC形态、大多数分子表型、细胞周期状态、脂肪和骨诱导分化能力与BM-MSC相似,但UC-MSC的CFU-F比例（1∶1609±0.18）高于BM-MSC的CFU-F比例（1∶35700±0.01）（p〈0.05）。此外,UC-MSC具有比BM-MSC更强的增殖能力（p〈0.05）。UC-MSCHLA-ABC和CD106分子表达低于BM-MSC（p〈0.05）。结论：脐带组织源间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与BM-MSC的相似,且具有比BM-MSC更高的增殖能力、较低的HLA-ABC和HLA-DR表达,UC-MSC有望成为BM-MSC理想的替代来源。     

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化Msc。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC—IC（long—term culture—initiating cells）实验,检测骨髓和脐带间充质千细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA—ABC,不表达HLA—DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MsC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC—IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC（colony forming cell）的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异（P〉0．05）;第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组（P〈0．05）。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论：从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。     

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法.方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能.结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能.早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法.     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应

为了研究兔骨髓间充质干细胞（rBM—MSC）的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM—MSC的免疫学表型；RT—PCR法检测其胶原表达；诱导rBM—MSC多向分化并使用特异性染色和RT—PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL—1、3、8和HGF对rBM—MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM—MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM—MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4．7％）；RT—PCR显示高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下．rBM—MSC可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM—MSC对IL-3最为敏感．10ng／ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P〈0．01），而高浓度IL-3能显著抑制其生长。结论：分离培养了rBM—MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM—MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。     

骨髓、脐带及脂肪来源间充质干细胞的成脂能力存在差异

间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）的来源非常广泛。由于不同组织来源的影响,MSC之间都会存在一定的差异。本研究分析比较脐带、脂肪及骨髓组织来源的MSC的基本生物学特性。从脐带、脂肪和骨髓分离培养MSC,在显微镜下观察这3种来源的MSC的形态（UC—MSC,AD—MSC和BM—MSC）,用流式细胞术诱导分化试验及定量荧光PCR分别检测UC-MSC,AD-MSC和BM-MSC的免疫表型、分化能力和过氧化物酶增殖激活受体-γ（peroxisomeproliferator—activatedreceptor-1,PPAR-1）mRNA的表达水平。结果表明,UC-MSC、AD-MSC和BM—MSC的形态都是成纤维细胞样;经罗丹明和DAPI染色后,用共聚焦显微镜观察发现它们的细胞形态类似;这三种来源Msc的免疫表型符合Msc的鉴定标准,而且表达水平一致;这三种来源MSC的成骨分化潜能相似,而成脂分化潜能存在较明显的差异,其中AD—MSC成脂能力最强,BM-MSC次之,UC-MSC最差。检测脂肪形成早期起重要作用的过氧化物酶增殖激活受体-γ（PPAR-1）mRNA表达水平在三种来源MSC中的基础表达水平,发现PPAR-γ mRNA在AD-MSC中最高,在BM—MSC次之,而在UC—MSC中最低,与成脂能力的表现相一致。这表明三种来源MSC成脂能力存在差异可能与它们PPAR-1的基础表达水平有关。结论：UC—MSC,AD—MSC和BM—MSC的形态类似;免疫表型符合MSC鉴定标准,表达水平一致;成骨分化能力相似,而成脂分化能力不同;PPAR-γ mRNA表达水平不一。关于差异的相关机制有待进一步研究。     

富血小板血浆优化培养间充质干细胞的实验研究

目的探讨以人富血小板血浆(PRP)取代动物血清培养可供临床应用的间充质干细胞(MSC)的新方法。方法骨髓标本取自行全髋关节置换术的造血功能正常患者的近端股骨。有核细胞2×10~5/cm~2接种于25 cm~2培养瓶中培养 MSC,比较含12.5% 胎牛血清(FCS)和12.5% 马血清的完全 Dexter 培养液,含10.0% FCS 的α-MEM 培养液和含5% PRP 的α-MEM 培养液三种培养体系的扩增效果。有核细胞1×10~6与采自健康供者髂骨的相同数量的骨髓细胞分别接种于25 cm~2培养瓶,14 d 后计数成纤维细胞集落(CFU-F)。结果从近端股骨中分离和扩增的细胞呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定 CD34、CD45阴性,SH2(CD105)、SH3(CD73)、Thy-1(CD90)阳性,体外诱导可向成骨细胞分化。其中含5% PRP 的培养体系较其他两种传统培养方法具有显著增强的 MSC 扩增效果且不改变细胞表型及分化功能;来源于近端股骨的骨髓细胞 CFU-F 较常规髂骨穿刺物显著增高(分别为89±17和16±5,P<0.01)。结论建立以 PRP 取代 FCS 的培养体系,并采用取自外科手术中近端股骨的骨髓标本可在体外高效扩增可备临床细胞治疗应用的 MSC。     

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSC）的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础.采用Percoll分离液（1.073/gml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定.结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴.结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定.本操作方案具有一定的临床应用价值.     

人脐血血清对人骨髓基质细胞增殖的实验研究

目的　探究人脐血血清对人骨髓基质细胞增殖的作用。方法　无菌条件下抽取新鲜脐血 ,经肝素抗凝、离心分离血清、灭活补体、微孔滤膜过滤制备人脐血血清 ,细胞按照一定浓度接种于DMEM / 2 0 %人脐血血清培养基 ,定期观察细胞生长并更换培养基。结果　细胞接种 2 4h后有少量梭形细胞贴壁 ,2周时细胞基本长满瓶底 ,细胞呈漩涡状排列。结论　在体外人骨髓基质细胞可在含人脐血血清的DMEM中增殖     

人脐带基质干细胞体外向雌性生殖细胞分化的潜能

背景: 骨髓间充质干细胞具有向卵母细胞分化的潜能,但是其免疫排斥和来源的有限性限制了其应用.研究表明,脐带间质干细胞也具有分化为卵母样细胞的潜能.目的: 建立分离培养人脐带间质干细胞的方法,观察其在体外向生殖细胞分化的潜能.方法: 无菌条件下取正常足月分娩新生儿的脐带,用Ⅰ型胶原酶消化,分离单个核细胞,DMEM培养,获得贴壁细胞,流式细胞仪检测其免疫表型.采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成软骨方向分化.通过RT-PCR检测脐带间质干细胞中生殖系特异性标记物的表达,采用卵泡液作为条件培养基,体外诱导脐带间质干细胞向生殖细胞分化.结果与结论: ①分离的脐带单核细胞培养后呈纺锤体样,体外增殖达10代以上,其分子免疫表型为:CD29、CD44、CD73(SH3)、CD90、CD105(SH2)阳性;SSEA-4弱阳性:CD31、CD34、CD45、HLA-DR阴性,与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似.在不同的诱导条件下,脐带间质干细胞可形成脂滴、骨结节、软骨结节等结构,并表达脂肪、骨及软骨细胞相关的特异性基因.②脐带间质干细胞表达OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系标记物,在含5%,10%,20%等不同浓度卵泡液的诱导条件下细胞可聚集分化形成卵母细胞样结构.     

不同体积分数脐血血清与骨髓间充质干细胞的增殖

背景：制备脐血血清体外扩增、培养间充质干细胞成为目前的研究热点,但尚无不同体积分数脐血血清对骨髓间充质干细胞的增殖能力的影响的报道。目的：观察比较不同体积分数的脐血血清对骨髓间充质干细胞的增殖能力的影响。方法：无菌条件下取20例人骨髓标本,采用密度梯度离心法提取单个核细胞,分别用体积分数为5%,7.5%,10%,15%,20%的脐血血清＋DMEM/F12培养基,行骨髓间充质细胞培养,取第3代细胞,用MTT法观察不同体积分数的脐血血清对间充质干细胞的增殖能力的影响。结果与结论：在体积分数5%,7.5%,10%的脐血血清＋DMEM/F12培养基组,细胞增殖能力较佳,明显优于体积分数15%,20%的脐血血清＋DMEM/F12培养基组,差异有显著性意义（P〈0.05）。说明在较低体积分数脐血血清培养体系中,骨髓间充质干细胞增殖状态活跃。     

PPARgamma insufficiency enhances osteogenesis through osteoblast formation from bone marrow progenitors

Based on the fact that aging is associated with a reciprocal decrease of osteogenesis and an increase of adipogenesis in bone marrow and that osteoblasts and adipocytes share a common progenitor, this study investigated the role of PPARgamma, a key regulator of adipocyte differentiation, in bone metabolism. Homozygous PPARgamma-deficient ES cells failed to differentiate into adipocytes, but spontaneously differentiated into osteoblasts, and these were restored by reintroduction of the PPARgamma gene. Heterozygous PPARgamma-deficient mice exhibited high bone mass with increased osteoblastogenesis, but normal osteoblast and osteoclast functions, and this effect was not mediated by insulin or leptin. The osteogenic effect of PPARgamma haploinsufficiency became prominent with aging but was not changed upon ovariectomy. The PPARgamma haploinsufficiency was confirmed to enhance osteoblastogenesis in the bone marrow cell culture but did not affect the cultures of differentiated osteoblasts or osteoclast-lineage cells. This study demonstrates a PPARgamma-dependent regulation of bone metabolism in vivo, in that PPARgamma insufficiency increases bone mass by stimulating osteoblastogenesis from bone marrow progenitors.     

影响脐血多能非造血成体干细胞分离的相关因素研究

为了研究低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素,探索优化培养条件,通过不同培养液、接种密度、首次换液时间对脐血多能非造血成体干细胞生长的影响的比较,并以选定的条件对其培养扩增,进行免疫表型及诱导分化能力检测。结果表明在低血清条件下,DMEM/F12培养液更适合于脐血多能非造血成体干细胞生长;1×106/cm2是原代培养的适宜接种密度,原代第72小时首次换液为最佳换液时问。利用所选条件培养的细胞可在体外持续扩增,并具有良好的分化潜能。结论建立了人脐血多能非造血成体干细胞的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索。     

两种分离脐血间充质干细胞的方法比较

背景：目前分离脐血间充质干细胞的方法很多,尚没有确定一种为最有效的方法。目的：寻找一种最为可靠的脐血间充质干细胞分离方法。方法：应用Percoll分离液法和羟乙基淀粉沉降法对脐血进行分离得到单核细胞,在含体积分数15%新生牛血清的DMEM/F12培养基中进行培养并传代。观察不同分离方法脐血单核细胞的回收率,每次传代的时间和细胞增值速度,培养过程中间充质干细胞形态的变化情况,并用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD90、CD44、CD34的表达。结果与结论：与Percoll分离液法相比羟乙基淀粉沉降法获得的单核细胞多,单核细胞回收率高（P〈0.01）,第1次传代时间短（P〈0.01）。然而两种方法获得的细胞经培养在形态的变化和表面标志物CD90、CD44、CD34的表达上差异并无显著性意义（P〉0.05）。所以羟乙基淀粉沉降法的分离效率较高,培养时间短,但是并不能获得质量较高的脐血间充质干细胞。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法（SP 法）测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。