体外构建的HSP70-肝癌抗原肽诱导抗原肽特异性免疫反应1

目的研究体外构建的HSP70-肝癌抗原肽复合物诱导针对肝癌的特异性免疫反应能力,为该复合物的临床应用奠定基础.方法在体外构建HSP70-肝癌抗原肽复合物,联合应用粒/巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)直接从志愿者外周血中培养出DC;以HSP70、HSP70-肝癌抗原肽、抗原肽分别刺激DC,DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),检测其杀伤T2细胞和肝癌细胞系的能力.结果HSP70-抗原肽、抗原肽均可诱导CD8+的抗原肽特异性CTL,而前者的诱导效果更强.结论体外构建的HSP70-抗原肽复合物具有免疫原性,HSP70可以增强抗原肽诱导特异性免疫反应的能力,HSP70-抗原肽复合物有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗.     

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

Hsp70-肿瘤抗原肽复合物修饰的DC疫苗体内外特异性抗瘤作用

目的 :探讨树突状细胞 (DC)及Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的体内外特异性抗瘤作用。方法 :采用一定的生化技术 ,从H2 2肝癌细胞中提取肿瘤抗原肽 ,并在体外与Hsp70进行结合 ;采用细胞培养技术 ,培养rmGM CSF、rmIL 4诱导的小鼠骨髓细胞 ,体外获取大量的DC ,后者经Hsp70 肿瘤抗原肽复合物修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞 ,通过MTT法进行检测淋巴细胞的激活 ;收集上述刺激传代培养的淋巴细胞 ,检测其对H2 2瘤细胞和艾氏腹水癌细胞的杀伤功能 ;采用H2 2瘤细胞肌肉接种和H2 2瘤细胞、艾氏腹水癌细胞腹腔接种 ,对接种小鼠给予经体外修饰的DC回输 ,观察其抑制肿瘤的效果。结果 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物可使DC成熟 ,大量分泌IL 12、TNF α、IL 1β等细胞因子 ,并能够使DC激活小鼠脾淋巴细胞 ;激活后传代培养的淋巴细胞对H2 2瘤细胞能够特异性地杀伤 ,而对艾氏腹水癌细胞无效 ;经Hsp 70 肿瘤抗原肽复合物修饰后的DC可作为一种有效的瘤苗 ,体内能特异性地抑制小鼠H2 2肿瘤生长。结论 :Hsp70 肿瘤抗原肽复合物能够很好地修饰体外诱导获取的DC ,使后者成为一种有效的瘤苗 ,体外能够特异性地激活淋巴细胞 ,体内有效地抑制肿瘤生长     

HSP70多肽复合物修饰树突细胞抗胰腺癌研究

目的：研究肿瘤热休克蛋白70（HSP70）多肽复合物修饰树突状细胞激活淋巴细胞治疗胰腺癌的策略和方法。方法：采用低渗裂解，ConA—Sepharose亲和层析柱及ADP—Agarose亲和层析柱，从小鼠胰腺癌（MPC83）瘤块中纯化HSP70多肽复合物；纯化出的70KD蛋白修饰小鼠骨髓来源诱导树突细胞（DC）并制备树突细胞HSP70多肽肿瘤疫苗，MTT法检测修饰后DC增殖活性；用修饰后DC激活小鼠脾淋巴细胞，MTT法检测激活淋巴细胞在不同效靶比下对MPC83的体外杀伤活性。结果：获得较高纯度分子量为70kD左右的蛋白质；50～100ng HSP70多肽复合物可修饰10^4树突细胞，每克瘤块能获取HSP70多肽复合物约100μg；来自MPC83细胞瘤块HSP70多肽复合物激活的淋巴细胞能特异性杀伤MPC83细胞。结论：采用低压亲和层析柱可从胰腺癌瘤块中获得较高纯度HSP70多肽复合物，HSP多肽复合物DC疫苗用于胰腺癌细胞免疫治疗能获得体外杀伤效果，为临床胰腺癌生物免疫治疗奠定基础。     

负载不同形式肝癌抗原的树突状细胞抑瘤功能的比较

目的：探讨不同形式的肝癌抗原修饰的树突状细胞(DC)的抑瘤功能。方法：分别用肝癌H22冻融抗原、H22小分子抗原肽和Hsp70-H22抗原肽复合物修饰DC；用MTT比色法分析DC激活的CTL对H22细胞的杀伤能力，并用RT-PCR法测定脾脏T细胞中IFN-γ mRNA的表达水平；用不同修饰的DC免疫小鼠，观察其对H22肝癌的生长抑制作用。结果：单独的H22肝癌抗原肽修饰的DC不能激活CTL。Hsp70-H22肽复合物修饰的DC激活CTL的能力强于H22肝癌冻融抗原修饰的DC，对H22细胞的杀伤率分别为47．3％和18．3％。各组T细胞中IFN-γ表达水平的变化与杀伤率的变化相一致。用H22肝癌冻融抗原和Hsp70-H22肽复合物修饰的DC免疫小鼠后，均可抑制H22细胞生长，但后者的抑制作用更强，成瘤率仅40％。其他各组的成瘤率均为100％。结论：Hsp70-H22肽复合物是一种DC的强致敏物．可通过激活CTL、诱导CD4^ T细胞分化成Th1型细胞而参与肝癌的免疫排斥。     

转染肿瘤总RNA的DC疫苗诱导抗肝癌特异性免疫

目的：探讨转染人肝癌总RNA的树突状细胞(DC) 疫苗体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。 方法： 采用原发性肝癌（HCC）病人外周血单核细胞（PBMC），在粒/巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4) 刺激下增殖分化为DC细胞；从人肝癌细胞中体外扩增肝癌RNA。以HCCRNA转染DC细胞，并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。MTT法测定CTL的杀瘤活性。 结果： 转染HCCRNA 48 h后， DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR表达明显增高。转染HepG-2细胞HCCRNA的DC和病人HCCRNA诱导的CTL对HepG-2细胞和病人HCC细胞的杀瘤活性均明显高于正常肝细胞RNA+DC、脂质体+DC、Opti-MEM+DC以及空白对照组；而对胃癌SGC-7901细胞无杀伤活性。 结论： 以肝癌RNA为肿瘤抗原，DC作为疫苗的抗原提呈细胞，体外冲击致敏DCs，能诱导肝癌特异性CTL。本研究为HCC术后复发和转移的防治提供一种可能有效的疫苗治疗方法。     

WT1多肽致敏树突状细胞诱导杀伤K562细胞实验研究

目的：研究来自健康人外周血单个核细胞的树突状细胞（DC）负载WT1多肽抗原，体外诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对K562细胞的杀伤作用。 方法： 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子，自外周血单个核细胞诱导扩增，培养出DC，使DC负载WT1多肽抗原。实验分3组，WT1多肽致敏DC为实验组A，未致敏DC为实验组B，单纯自体淋巴细胞未加DC激活为对照组C，观察CTL对K562细胞的杀伤作用。 结果： 培养出具有典型特征的DC，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为20∶1时，实验组A诱导的CTL对K562细胞的杀伤率为86.1%±26.8%；实验组B为47.1%±20.8%；对照组C为27.7%±15.3% (P＜0.05)。 结论： WT1多肽抗原致敏DC能促使CD8阳性淋巴细胞扩增，并诱导激活特异性CTL，对K562靶细胞具有明显的杀伤作用。     

不同大鼠胶质瘤抗原致敏的DC体外诱导CTL活性的研究

目的: 比较大鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells, DC)体外经由大鼠C6胶质瘤细胞由不同方式制备的不同抗原致敏后,对特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的诱导作用。方法: 自大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)+白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增;由C6胶质瘤细胞经由反复冻融、煮沸灭活及超声破碎细胞抽提其总蛋白的方法制备各种不同抗原致敏DC,致敏的DC与T淋巴细胞进行共培养诱导CTL;以ELISA法检测CTL诱导过程中淋巴细胞趋化因子(lymphocyte chemoattractant factor)及细胞因子IFN-γ分泌水平:以 -TdR掺入法检测DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL杀伤活性。 结果: 体外应用煮沸灭活瘤细胞制备的肿瘤抗原致敏DC,能诱导更强的刺激T细胞增殖的能力、并且可以诱导杀伤活性更强的CTL。结论: 应用煮沸灭活的瘤细胞制备瘤抗原负载DC获得瘤苗可获得更强的抗肿瘤保护作用。     

rhHSP70-HER2/neu抗原肽对小鼠乳腺癌的治疗作用研究

目的：使用在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70与合成的胍R2／neu抗原肽在特定条件下形成复合物，探讨其用于肿瘤生物治疗的可行性。方法：在ADP存在的条件下，将rhHSP70与合成的HER2／neu抗原肽体外非共价结合形成复合物，并分次免疫BALB／c小鼠，检测该复合物诱导特异性CTL的能力和对小鼠乳腺癌的治疗作用。结果：rhHSP70-HER2／neu抗原肽复合物免疫小鼠后，可以诱导出肿瘤特异性CTL，并对小鼠的乳腺癌有明显的治疗作用。结论：在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70可以在体外与一定的抗原肽非共价结合形成复合物，该复合物具有较强的诱导特异性CTL的能力。     

人乳头状瘤病毒11型E7抗原HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定

目的 筛选和鉴定人乳头状瘤病毒11型E7抗原(HPVllE7)HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位.方法 预测HPVllE7抗原HLA-A*0201限制性CTL表位并合成相对应的表位多肽和四聚体(tetramer),即HPVllE7 7-15(TLKDIVLDL)、15-23(LQPPDPVGL)、47-55(PLTQHYQIL)、81-89(DLLLGTLNI)和82-90(LLLGTLNIV).从健康HLA-A*0201成人外周血单一核细胞诱导树突状细胞(DC)并负载上述表位多肽,流式细胞技术检测DC成熟分化标记及ELISA法检测DC分泌的IL-12;成熟DC负载各组多肽后观察DC激活T淋巴细胞的效应,ELISA法检测T细胞分泌的IFN-γ;四聚体检测抗原特异性CD8+ T细胞及乳酸脱氢酶(LDH)释放法评价DC诱导的CTL对靶细胞的特异性体外杀伤效应.结果 预测的5条HPVllE7表位多肽均能诱导DC的成熟分化;E7 7-15、82-90和15-23多肽负载的DC能激活T淋巴细胞分泌高水平IFN-γ;E7 7-15多肽负载的DC能刺激特异性tetramer+CD8+细胞增殖且其诱导的CTL对HPVllE7/293细胞产生高效率的特异性杀伤作用(P<0.05).结论 筛选并鉴定出1条HPVllE7HLA-A*0201限制性CTL表位E7 7-15(TLKDIVLDL),负载该表位肽的DC体外可诱导高效、特异性的CTL效应,抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位.     

HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的：构建2种HBV抗原肽-HLA-A＋2402复合物四聚体，并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞（CTL）。方法：原核高效表达HLA-A＋2402-BSP和β2m蛋白后，分别与乙型肝炎病毒抗原肽P01756-764和Corell7-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A＋2402抗原肽复合物单体，经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体，分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体。最后进行流式细胞术检测。结果：Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A＋2402复合物单体。结论：构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL。     

sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测

目的：构建有功能的sHLA-A＊0201-抗原肽四聚体，建立一套HLA Ⅰ类分子／抗原肽的四聚体制备技术。方法：利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A＊0201-LMP2A426-434复合物分子，并在BirA酶的作用下生物素化。与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4：1结合而形成HLA-A＊0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测，同时用细胞毒实验验证。结果：荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A＊0201-抗原肽复合物分子正确结合，制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论：从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A＊0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础，也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。     

小鼠胃癌MAGE3抗原H-2K~k限制性抗原肽的筛选

本研究对小鼠胃癌MAGE3抗原H 2Kk 限制性的抗原肽进行了筛选。用CTL表位预测的基序法对易与H 2Kk 结合的多肽序列进行了预测并人工合成了 4个多肽。在体外检测了各多肽刺激H 2Kk 型小鼠T细胞增殖和分泌IFN γ的能力 ,同时测定了各多肽诱导出的CTL对小鼠前胃癌细胞株MFC细胞的杀伤活性。结果显示 ,抗原肽MAGE31 3 0 1 3 7可有效地刺激特异性T细胞的增殖和分泌细胞因子IFN γ ,其诱导出的CTL细胞对MFC细胞也有较高的杀伤活性。这些实验结果证实抗原肽MAGE31 3 0 1 3 7可以作为多肽疫苗来对表达MAGE3抗原的H 2Kk 型小鼠胃癌进行免疫治疗。     

小鼠肝癌总RNA转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的研究

目的 :探讨小鼠骨髓树突状细胞 (dendriticcell,DC)体外经Hepa 1 6肝癌细胞株总RNA转染后 ,对特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的诱导作用。方法 :自小鼠骨髓分离DC前体细胞 ,经GM CSF IL 4培养、扩增 ;制备Hepa 1 6小鼠肝癌细胞株总RNA ,体外转染DC ,检测DC诱导同基因型小鼠T细胞增殖及其特异性CTL的反应能力。结果 :经Hepa 1 6肝癌细胞总RNA转染的DC ,其组织相容性分子 (MHC I、II)及共刺激分子 (B7 1 、B7 2 )表达明显增高 ,刺激同基因型小鼠T细胞增殖能力增强 ,且能诱导Hepa 1 6特异性CTL。结论 :以肝癌总RNA转染DC ,构造肝癌疫苗为肝癌的临床治疗提供了新的策略。     

NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究

目的利用合成的HLA-A02限制性NY—ESO-1 p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽,体外通过抗原递呈细胞诱导HCC患者外周血T淋巴细胞,从而成功诱导出特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。方法通过SSP方法筛选20例HLA—A＊02的HCC患者的HLA亚型;通过逆转录多聚酶链反应和测序分析NY—ESO-1和MAGE—A3在肝癌组织中的表达以及多肽表位密集区的核苷酸变异状况;体外用细胞因子培养HCC患者外周血来源的树突状细胞（DC）;人工合成HLA—A＊02限制性NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3 p271—279多肽,直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外同T淋巴细胞孵育16d后,利用Elispot、细胞内细胞因子染色和四聚体实验检测T细胞免疫应答。结果20例HLA—A＊02患者中,NY-ESO-1mRNA阳性患者为11例,MAGE—A3mRNA阳性患者12例。中国HCC患者表达的NY—ESO-1和MAGE—A3序列高度保守。经多肽直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外活化外周血T淋巴细胞,4例（36．4％）NY—ESO-1阳性HCC患者以及4例（33．3％）MAGE．A3患者产生针对多肽特异性的CD8’T细胞免疫应答。不同HLA—A＊02亚型HCC患者可产生针对NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽的免疫应答。结论NY—ESO-1p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以诱导出针对抗原肽的特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。提示HLA—A＊02限制性的NY-ESO-1 p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

肝癌DC疫苗诱导CTL的效应与机理研究

目的 探讨肝癌DC疫苗诱导肝癌特异性淋巴细胞的效应与机理。方法 用流式细胞术检测肝癌细胞表面HLA-DR的表达；用GM-CSF和IL-4从健康人外周血诱导DC，使之负载肝癌相关抗原，并在BCG HSP-70作用下活化，制成肝癌DC疫苗；用流式细胞术检测BCG HSP 70活化的负载肝癌抗原DC对自身淋巴细胞的活化；分别用MTT法和ELISA检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞培养上清中TNF和IL-12水平；用原位杂交检测淋巴细胞内IFN-γ mRNA表达；用流式细胞术检测经DC疫苗活化后淋巴细胞表面Fas-L表达；最后检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤。结果 肝癌DC疫苗在体外诱导活化的淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤以CD4^ T CTL为主，不但可以杀伤SMMC-7721细胞，同时对其它3种肝癌细胞也有不同程度的杀伤。CTL培养上清液和细胞中可分别检测到TH1型细胞因子TNF和IFN-γ mRNA。Fas和Fas配体途径发挥了重要的作用。结论 为肝癌DC疫苗的进一步深入研究及今后的临床应用奠定了良好的基础。     

肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导肺癌患者特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的：为了探讨肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力。方法：采用分离肺癌患者外周血单核细胞体外诱导DC细胞，Trizol法提取肺癌细胞系Calu-6总RNA，用脂质体包裹总RNA转染DC并诱导特异性CTL的扩增，LDH法和ELISA法检测CTL的杀伤活性和IFN-γ分泌。结果：经肺癌细胞总RNA转染的DC特异性表面标志及功能相关分子表达均上调，转染后的DC可显著刺激异体／自体T淋巴细胞增殖，诱导的特异性CTL对携带Calu-6抗原的靶细胞的杀伤率显著高于LAK细胞，再次接触相同抗原时其IFN-γ分泌量显著增高。结论：肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗可在体外诱导出特异性抗肿瘤免疫。     

人食管癌TE-1细胞MHC-Ⅰ相关抗原肽的初步研究

目的寻找TE-1细胞MHC-Ⅰ类分子提呈的抗原肽。方法用弱酸洗涤法获得TE-1细胞表面与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽，经SepPak-C18柱、Centrion-3超滤器和RP-HPLE去盐纯化后，用负载该抗原肽的树突状细胞刺激生成肿瘤特异性杀伤细胞，以Cr^51释放法测定CTL的杀伤活性。结果高效液相色谱图显示多个峰；负载抗原肽DC刺激的CTL比未负载抗原肽DC刺激的CTL对TE-1细胞杀伤率高，两者差异有统计学意义；负载抗原肽DC刺激的CTL对与抗原肽孵育的T2细胞比对未经与抗原肽孵育的T2细胞杀伤率高，两者差异有统计学意义。结论弱酸洗涤法可从TE-1细胞上获得有效的抗原肽；混合抗原肽中有可与HLA-A2分子结合并能激发CTL的抗原肽。     

CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定

目的：鉴定CTL识别的HLA—A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位。方法：以细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC)，通过形态学观察和流式细胞术进行鉴定。用表位预测法选取并合成两种肽分子，分别脉冲成熟的DC，并刺激HLA—A2^ 健康人自体CD8^ T细胞，1wk后，用脉冲肽的自体PBMC以每7d的间隔刺激该CD8^ T细胞3次。以共接受4次抗原肽刺激的T细胞作为CTL，用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验，检测CTL对靶细胞的杀伤效应。用酶联免疫斑点法(ELISPOT)．检测CTL中抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞数。结果：形态学和流式细胞术的结果显示．PBMC可诱生成熟的DC。肽1235(FLPDHINIV)诱导的CTL．可特异性杀伤1235脉冲的T2细胞和OVA66^ 、HLA—A2^ 的SW480细胞，且L235诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞数增加。结论：卵巢癌相关抗原OVA66的HLA—A2限制性CTL表位1235．能激发对肿瘤抗原的特异性免疫应答，为制备肿瘤特异性肽疫苗奠定了实验基础。     

三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的 体外构建三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体,并初步用该三种四聚体对抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)进行了初步检测.方法 原核高效表达的HLA-A*0201-BSP和β2m蛋白,分别和三种HBV抗原肽(HBVCore18-27,Env335-343,Po1575-583)体外复性折叠成可溶性的HLA-A*0201抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成相应的三种抗原肽四聚体.最后进行流式细胞仪检测.结果 Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了三种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体.构建的三种四聚体均可以检测到相应特异性的CTL,在自限性感染患者体内针对乙肝核心抗原(core18-27)的CTL细胞频数(0.18%)高于针对聚合酶抗原(po1575-583)(0.08%)和包膜抗原(env335-343)(0.06%).结论 成功构建了三种具有完整构象的生物素化HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体,所构建的三种四聚体都可以检测到抗原特异性的CTL.