大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

基于RT-PCR基础上的体内重组法构建人源性胶质瘤单链抗体库

目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　经逆转录、套式PCR从脑胶质瘤患者血淋巴细胞中扩增出抗体轻链Vκ 和重链VH 基因 .先构建Vκ 基因库 ,并使连接Vκ 和VH基因的Linker与Vκ 基因连接 ,再将VH 基因克隆入Vκ 基因库 ,即构建成约为 3.5× 10 6 的单链抗体 (ScFv)基因库 .以Loxp5 11序列替代Linker序列 ,并将ScFv克隆入pDNA5内进行重组、鉴定 ,得到新的ScFv噬菌体抗体库 .结果　表明原初级噬菌体抗体库经Cre Loxp5 11系统重组后库容量达到 8.5× 10 8,部分测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论　利用体内重组系统明显提高了所建的抗体库容量 ,为进一步筛选特异性人源性抗脑胶质瘤ScFv奠定了基础     

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT...     

用Cre-Loxp系统构建人胶质瘤单链抗体噬菌体抗体库

目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　从胶质瘤患者外周血淋巴细胞中提取细胞总 RNA,经逆转录后用套式 PCR分别扩增抗体轻链 Vκ 和重链 VH 基因 .分别构建 Vκ5 .5× 10 6,VH3.5× 10 6基因库 ,连接 Vκ和 VH构建单链抗体 (Sc Fv)基因库 ,并克隆入表达载体 p DNA5内进行重组 ,得到 Sc Fv噬菌体抗体库 .结果　表明经 Cre- L oxp5 11系统重组后 ,噬菌体抗体库库容量达到 6 .0× 10 8,测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论　利用 Cre- L oxp5 11胞内重组系统成功地构建了较大容量的人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选特异性人源性胶质瘤 Sc Fv奠定了基础 .     

人源肺腺癌单链抗体基因文库的构建

目的:制备人源抗肺腺癌单链抗体(Single-chain variable fragment,scFv)基因文库.方法:利用肺腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,通过RT-PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过"剪切重叠延伸PCR"(Splicingover-lapping extend PCR,SOE-PCR)而形成scFv基因片断.将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转入Ecoli TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物.结果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源抗肺腺癌scFv基因片断,为进一步筛选人源抗肺腺癌scFv库提供了试验基础. 入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转AEcoh TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物. 果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源     

卵巢癌人源性核糖体展示抗体库的构建

目的构建库容量大、多样性好的卵巢癌人源性核糖体展示抗体库。方法从10名卵巢癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增人全套重链可变区基因（variable region of heavychain,V_H）和轻链可变区基因（variable region of light chain,V_L）,用重叠PCR技术对它们进行拼接,构建卵巢癌人源单链抗体库,并连接T载体转化大肠杆菌,经蓝白筛选,挑选阳性克隆,测序鉴定。结果成功构建卵巢癌人源单链抗体库,库容6.5×10~（13）,经测序验证多样性良好。结论成功构建的卵巢癌人源单链抗体库可用于进一步筛选目标抗原,为开发治疗性人源抗体奠定了实验基础。     

鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建

目的　构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法　用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果　ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论　成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。     

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源乳腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选乳腺癌特异性单链抗体(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌噬菌体抗体库。通过正常乳腺细胞(MCF-10F)和乳腺癌细胞(MCF-7)筛选富集后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测噬菌体抗体活性。结果成功的构建了1个4.2×107的噬菌体抗体库,并从该库中筛选到6株对乳腺癌细胞株MCF-7有结合活性的阳性克隆。结论从人源乳腺癌噬菌体抗体库中筛选到6株特异性噬菌体抗体,为下一步进行单链抗体的乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。     

人源乳腺癌单链抗体基因的构建

目的：构建人源抗乳腺癌单链抗体（scfv）基因片断。方法：首先利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,然后通过RT—PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过“重叠-延伸-拼接PCR”（SOE—PCR）而形成单链抗体（scfv）基因片断。结果：构建了750bp的人源抗乳腺癌单链抗体（scfv）基因片断。结论：成功地构建了人源抗乳腺癌单链抗体基因片断,为进一步构建人源抗乳腺癌单链抗体库提供了试验基础。     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的 构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,为抗体研究提供方便有效的技术平台.方法 收集健康献血志愿者的白细胞悬液,离心分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库,并通过第2次重叠延伸PCR在scFv DNA序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,其3'端添加6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成核糖体展示天然人源scFv文库.结果 成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达1013以上.结论 成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库,为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台.     

抗HCMV人源化噬菌体抗体库的构建

目的构建抗巨细胞病毒噬菌体抗体库,为制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体奠定基础.方法以巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料,建立噬菌体抗体库,并对其进行鉴定.结果构建完成了一个库容为6.5 ×106cfu/ml的噬菌体抗体库.结论人源化抗巨细胞病毒噬菌体抗体库的建立为下一步抗体的筛选和表达奠定了基础.     

Modification and identification of a vector for making a large phage antibody library

Background The large phage antibody library is used to obtain high-affinity human antibody, and the Loxp/cre site-specific recombination system is a potential method for constructing a large phage antibody library. In the present study, a phage antibody library vector pDF was reconstructed to construct diabody more quickly and conveniently without injury to homologous recombination and the expression function of the vector and thus to integrate construction of the large phage antibody library with the preparation of diabodies. Methods scFv was obtained by overlap polymerase chain reaction (PCR) amplification with the newly designed VL and VH extension primers. loxp511 was flanked by VL and VH and the endonuclease ACC Ⅲ encoding sequences were introduced on both sides of loxp511. scFv was cloned into the vector pDF to obtain the vector pDscFv. The vector expression function was identified and the feasibility of diabody preparation was evaluated. A large phage antibody library was constructed in pDscFv. Several antigens were used to screen the antibody library and the quality of the antibody library was evaluated. Results The phage antibody library expression vector pDscFv was successfully constructed and confirmed to express functional scFv. The large phage antibody library constructed using this vector was of high diversity. Screening of the library on 6 antigens confirmed the generation of specific antibodies to these antigens. Two antibodies were subjected to enzymatic digestion and were prepared into diabody with functional expression. Conclusions The reconstructed vector pDscFv retains its recombination capability and expression function and can be used to construct large phage antibody libraries. It can be used as a convenient and quick method for preparing diabodies after simple enzymatic digestion, which facilitates clinical trials and application of antibody therapy.