双重RAS阻断与单药治疗在非老年CKD1-3a期糖尿病肾病的疗效及安全性比较分析

目的 评价双重肾素-血管紧张素系统(RAS)阻断策略与单药优化治疗策略在非老年慢性肾脏病(CKD)1-3 a期糖尿病肾病患者中的疗效及安全性.方法 采用回顾性研究,从CKD随访管理系统中纳入45例接受双重RAS阻断治疗的非老年(WHO标准:<60岁)CKD1-3a期糖尿病肾病患者(双重RAS阻断组).随后,采用倾向评分...     

SARS病毒17株蛋白质序列的初步分析

SARS是一种传染性很强的呼吸系统疾病,分析其致病病毒各株的序列特征,旨在进一步研究SARS病毒的感染途径、免疫机制及预防治疗方案等。作者对已测序的17株SARS病毒的核酸序列进行了N—J进化树分析,预测了各株病毒5种主要蛋白的编码序列,初步分析了各株SARS病毒5种蛋白核酸编码序列及氨基酸序列的突变情况。     

重组SARS-CoV刺突蛋白基因片段的原核表达及纯化

目的:冠状病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒的主要结构蛋白之一,也是重要的病毒抗原,重组S蛋白的表达可用于检测病毒感染后血清抗体.方法:根据抗原性预测分析结果,将S蛋白中抗原决定簇的编码基因重新拼接成两个新的基因,通过全基因合成方式直接合成至原核表达载体pET32a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA试剂盒纯化目的蛋白.结果:SDS-PAGE证实重组S蛋白的表达,并被纯化.结论:重组刺突蛋白的表达及纯化,可做为检测SARS-CoV抗体的抗原,有助于进一步开展SARS-CoV相关研究.     

SARS病毒S蛋白的B细胞表位预测

目的预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.方法基于SARS 蛋白基因组序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案,Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对S蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.结果推测最有可能的B细胞表位位于S蛋白N端第91～98区段、第1 121～1 153区段和第185～193区段内或它们的附近.其它,如S蛋白N端第1 050～1 059、752～765、41～50、666～674、264～287、340～348、408～416区段和第424～439区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论用多参数预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位,为分子免疫学的深入研究提供线索.     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

Expression and Purification of SARS Coronavirus Membrane Protein

To construct a recombinant plasmid Pet23a-M, the gene encoding severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus membrane protein was amplified by RT-PCR and cloned into the expression plasmid Pet23a. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA sequencing analysis revealed that the cloned DNA sequence was the same as that reported. The recombinants were transformed into Escherichia coli (E. Coli) BL21 (DE3) and induced by Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of 27 kD (1 kD=0. 992 1 ku) protein was detected by SDS-PAGE and pured by metal chelated chromatography. Results of Western-blot showed that this expressed protein could react with antibodies in sera of SARS patients during convalescence. This provided the basis for the further study on SARS virus vaccine and diagnostic agents.     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

儿科患者与医务人员血清冠状病毒(变异株)抗体检测

目的本次严重急性呼吸综合征(SARS)流行中,儿童发病率低、症状轻,推测儿童可能存在保护性抗体.对儿科非SARS患者及医务人员进行血清冠状病毒(变异株)抗体检测,试剂盒为北京华大吉比爱生物技术有限公司冠状病毒(变异株)IgG抗体检测试剂盒(国药试字2003004批号20030501).方法用酶联免疫吸附法(ELISA),检测2001及2003年的168例非SARS患儿的血清标本,及与这些患儿有密切接触的171份医务人员血清标本,以86份成人非感染非医务人员血清标本做对照.结果非SARS患儿2001年77份血清标本阳性32例(41.56%),2003年91份阳性36例(39.56 %),医务人员抗体阳性2例(1.17%),成人对照为0%.儿童冠状病毒(变异株)抗体阳性率有随年龄增长逐渐下降的趋势.抗体滴度中位数在2003年患儿(0.200)、2001年患儿(0.170)、医务人员(0.019)及非感染成人(0.054)间存在极显著性差异.结论在非SARS患儿中冠状病毒(变异株)抗体阳性率高达40%,显著高于成人,与其密切接触的医务人员抗体阳性的检出率与对照组无明显差异,抗体滴度无升高.     

SARS 冠状病毒S2蛋白胞外段的原核表达及其细胞膜融合效应研究

目的 构建SARS冠状病毒S2蛋白胞外段( S2ED)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达质粒,获得在原核细胞中表达的目的 蛋白.方法 在生物信息学预测基础上,利用PCR方法 扩增S2ED和EGFP的编码序列,插入到质粒pET-14b中构建融合表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白His-S2ED-EGFP.采用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白可溶部分,利用SDS-PAGE和免疫印迹的方法 鉴定纯化后的蛋白,通过荧光显微镜考察S2ED与Hela细胞胞膜能否发生融合效应.结果 重组质粒pET-14b-S2ED- EGFP的构建正确无误,并能够在BL21(DE3)中高效表达.纯化后的蛋白与Hela细胞孵育后,未观察到蛋白通过膜融合的过程内化进入细胞.结论 S2ED的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功,并在原核细胞中获得了部分可溶的表达和有效的纯化.虽然原核表达的重组蛋白未能在Hela细胞上发挥预期的生物学效应,但是该工作将为加深S2蛋白介导的胞膜融合过程的认识以及未来进行以特异性细胞结合肽为基础的定向靶细胞转运系统研究奠定重要的基础.     

非SARS患儿体内SARS冠状病毒抗体的检测分析

目的探讨非急性重症呼吸综合征(SARS)患儿体内是否存有SARS冠状病毒相关抗体。方法采用国家药品生物制品检定所正式检定通过的2种SARS抗体诊断试剂(间接免疫荧光检测试剂和双抗原夹心ELISA试剂),对广州地区1 060例非SARS患儿血清样本进行检测。结果1 060例非SARS患儿血清样本,间接免疫荧光法检测IgM、IgG均为阴性。双抗原夹心ELISA法检测也仅有2例出现弱阳性。结论非SARS患儿体内并未存在SARS病毒相关抗体。     

禽冠状病毒的分离鉴定及膜蛋白基因的克隆

目的分离鉴定禽冠状病毒,对该病毒的M基因序列进行分析。方法采用鸡胚传代分离培养病毒,用血凝特性、鸡胚半数感染量(EID50)、鸡胚矮小化、动物回归试验等方法鉴定病毒,用RT-PCR克隆病毒的膜蛋白基因并对其测序。结果分离病毒的生物学特性符合禽冠状病毒,膜蛋白基因与标准毒株膜蛋白基因为核苷酸序列同源性为91.9%,氨基酸的同源性为92.5%。结论本研究分离到1株禽冠状病毒,命名为IBV-HN05,该毒株可能是疫苗株的变异株。