西藏小型猪胰岛细胞体外分离和纯化方法

的确定成体西藏小型猪胰岛细胞体外分离、纯化的理想条件,为异种移植治疗糖尿病提供高质量的胰岛细胞。方法对比不同质量浓度的胶原酶（1mg／ml,2mg／ml,3mg／ml,4mg／m1）和同一质量浓度不同时间点（0min,15min,30min,45min,60min,75min,90min）分离获得胰岛细胞的数量和效果;使用Ficoll400密度梯度离心、淋巴分离液分离、离心和静置4种方法纯化胰岛细胞悬液,比较最终收集到的胰岛细胞数量和效果;用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO／PI染色计算胰岛细胞存活率。结果确定了不同质量浓度的胶原酶获取胰岛细胞的最佳时间,胶原酶lmg／ml和2mg／ml组为45min,3mg／ml和4mg／ml组为30min,各组在最佳时间点获得胰岛细胞的数量最多的为1mg／ml组,胰岛细胞形态完整;4种纯化方法中,收集的胰岛细胞数量由多到少依次为静置组〉Ficoll400密度梯度离心组〉离心组〉淋巴分离液离心组。经AO／PI染色后检测胰岛细胞的存活率为95．00％以上。结论在组织块剪碎消化的情况下,胶原酶质量浓度lmg／ml、消化时间45min的分离条件可获得数量较多的胰岛细胞,Ficoll400密度梯度离心的纯化手段收集到的胰岛细胞效果最好。     

云南小耳猪胰岛细胞的分离和纯化方法

目的探索云南小耳猪胰岛细胞分离和纯化的有效方法.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离小耳猪胰腺;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为（4580±257）IEQ/g胰腺,纯化后为（3660±449）IEQ/g胰腺,纯度为80%左右,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离小耳猪胰岛,腱岛细胞产量、纯度较高,功能良好,为进一步成人胰岛细胞的分离纯化提供了实验依据.     

成年猪胰岛的分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对成年猪胰岛的分离效果.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离成年猪胰腺脾叶;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为8339±2305胰岛数/g胰腺,纯化后胰岛数/g胰腺为4367±1876,纯度为85%,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离成年猪胰岛,胰岛细胞产量、纯度较高,功能良好.     

对大鼠胰岛两种不同分离纯化方法的实验研究

目的 选择最佳鼠胰岛的制备方法。方法 采用不同的胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 Dextran法和Ficoll法分离纯化出胰岛细胞成活率无明显差异，且价格相差数十倍。结论 可以用Dextran纯化液替代Ficoll纯化液。     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

成年猪和大鼠胰岛分离纯化的实验研究

目的 选择最佳猪、鼠胰岛的制备方法。方法 采用不贩 胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 选出了制备适合猪、鼠胰岛的最佳方法。结论 由于猪、鼠胰腺结构的不同，制备胰岛细胞应采取不同的消化及纯化方法。     

成人胰岛细胞的分离纯化与应用

目的 探讨成人胰岛细胞分离纯化技术,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞.方法 使用LiberaseHI复合胶原酶和改良的Recordi自动胰岛细胞分离技术分离胰岛,采用COBE2991细胞淘洗仪连续密度梯度离心纯化胰岛细胞,用DTZ和AO-PI染色显微镜下评价胰岛细胞的数量、纯度和活性.结果 该组研究共分离30例胰腺的胰岛,获得胰岛细胞数量平均为(316626±191972)IEQ,平均每克胰腺收获胰岛细胞3389 IEQ,收获的胰岛纯度平均为(74.70±7.84)%,活度平均为(94.10±2.19)%,胰岛细胞刺激指数平均为(3.68±0.58).在此基础上,成功实施7人12次的成人胰岛细胞移植.结论 成功建立了改良的Recordi自动胰岛分离技术,获得大量高纯度有活性的胰岛细胞,为开展胰岛细胞临床移植提供了保障.     

从培养细胞中快速提取总RNA的简便方法

在分子生物学实验中 ,RNA提取常常是令研究人员尤其是初学者头疼的项目 ,因为 RNA酶在自然环境中广泛存在 ,且不易失活 ,所以 ,很难方便地提取纯度和完整性均满足分子生物学实验需要的 RNA分子。尽管目前已有异硫氰酸胍 - Cs Cl超速离心法 [1 ]、TRIzol试剂法 [2 ]等各种各样提取RNA的方法 ,但是 ,这些方法中有些方法步骤繁琐 ,耗时长 ,有些方法所需试剂昂贵 ,消耗大。笔者在实验中使用肝素作为 RNase抑制剂 ,结合 L i Cl特异沉淀 RNA,摸索一种新的从培养细胞中提取总 RNA的快速简便方法。1　材料与方法1.1　试剂1.1.1　 TEL　 …     

HCG单克隆抗体的一种简便、快速纯化方法

本文介绍的是采用羟磷灰石柱层析从BALB/c小鼠腹水中纯化HCG单克隆抗体的方法。由于该方法直接从腹水中纯化相应的单克隆抗体,与目前应用的其它纯化单克隆抗体的方法比较有简便易行,快速的特点,且纯化的抗体生物活性可靠,纯度较高,同时抗体损失小。该方法同样适用于从BALB/c小鼠腹水中及杂交瘤细胞培养上清液中纯化其它的单克隆抗体。     

一种简便经济的肝星状细胞分离方法

目的　介绍一种简易、经济、高产的肝星状细胞 (HSC)分离方法 ,为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法　参照国内外方法加以改良 ,应用D hanks液校正淋巴细胞分离液 ,使其为 1 0 53 ,采用单层一步梯度离心法分离HSC。结果　细胞获得量为 (3 5± 0 5)× 1 0 7/只 ,存活率、纯度均在 95 %以上。结论　本方法简便、实用、高产 ,不需特殊设备 ,便于推广应用     

一种改进的分离纯化人肝脏星形细胞的方法

目的：改进传统的分离纯化人肝脏星形细胞（HSCs）的方法。方法：在传统的分离人HSCs方法的基础上，省略链霉蛋白酶消化，仅用Ⅳ型胶原酶消化，采用低速离心去除肝脏实质细胞，将获得的肝脏非实质细胞进行两次换液及传1代培养，观察培养过程中细胞形态及蛋白标志物的改变。结果：经传1代培养24h后，所分离得到的人HSCs纯度接近100％。结论：所改进的分离人HSCs的方法具有操作简便，收获细胞纯度高的特点。     

推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化大鼠胰岛

目的 探索用简化的单一密度梯度法建立快速纯化大鼠胰岛细胞的方法.方法 用胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺,采用自制的推进式离心管以及单一密度(1.090 g/cm3)的HCA-Ficoll-400密度梯度液来纯化大鼠胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能.结果 纯化后平均每条SD大鼠胰腺可获得(731±89)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(73.2±9.4)%.平均活率为(92.8±2.4)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的3.54±O.79倍(P＜o.001).结论 为各种胰岛细胞的实验研究建立了快速分离纯化胰岛细胞的方法,纯化的胰岛细胞功能良好.     

一种培养鉴定风疹病毒的简便试验方法的建立

目的建立使风疹病毒(RV)在Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞株)上产生的细胞病变效应(CPE)易于观察的简便试验方法,以利于病毒的分离、培养与鉴定.方法在RV接种Vero细胞4天后,用不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)的融合营养液处理细胞,继续按常规条件培养1天后,在倒置显微镜下观察RV引起的特征性CPE-多核巨细胞,染色后计数多核巨细胞的形成率.同时检测在不同条件(融合时间、病毒接种初始滴度)下,多核巨细胞形成率的变化.结果感染RV的Vero细胞经过酸性融合营养液的处理,可出现RV特征性CPE-多核巨细胞.发现在37℃、pH 5.0的酸性融合营养液处理染毒细胞10 min后,继续培养1天,出现的细胞病变形态最典型,染色后计数发现多核巨细胞的形成率最高,为14.7%(P<0.01).融合处理的时间对多核巨细胞的形成率没有影响.随着病毒接种初始滴度的降低,多核巨细胞的形成率也相应降低.结论此方法简单、易行,使RV在Vero细胞上产生的细胞病变清晰易观察.     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

试管法纯化人胰岛细胞的初步研究

目的　探索用试管法初步建立纯化人胰岛细胞的方法。方法　用胶原酶P两步法消化分离胰腺 ,用试管法通过不连续密度梯度HC -A -Ficoll纯化液纯化人胰岛细胞。通过DTZ染色 ,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度 ,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果　纯化后平均每个胰腺可获得 (5 35 0 0±2 1 4 6 5 )个胰岛细胞团 ,平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团 (75 0± 2 6 7) ,平均纯度为 72 92 %。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好 ,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的 1 89倍 (P <0 0 1 )。结论　建立了人胰岛细胞纯化的方法 ,纯化的胰岛细胞功能良好