靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

HCV核心蛋白对HepG2 细胞microRNA表达谱的影响

 摘要：目的 分析HCV核心蛋白（HCV-Core）对HepG2细胞microRNA表达谱的影响。方法 将构建好的重组真核表达质粒pCDNA3.1（+）/HCV-Core用脂质体转染HepG2细胞,经G418筛选得到稳定转染HCV-Core的HepG2细胞,命名为HepG2-HCV Core细胞株。然后用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）,细胞免疫荧光和Western blot对HCV核心蛋白在HepG2细胞里mRNA和蛋白水平的表达情况进行验证。利用博奥生物公司的miRNA Array基因芯片,分析稳定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞和转染空质粒pCDNA3.1（+）的HepG2细胞二者microRNA表达谱的差异,最后用Taqman探针荧光定量PCR法进行验证。 结果 感染HCV-Core后,HepG2细胞表达有差异的microRNA有8种,用Taqman探针荧光定量PCR法进行分析,发现HCV核心蛋白可以上调miR-29、 miR-146a、miR-149、miR-192、miR-221、miR-222和miR-193b;下调miR-196a。结论 HCV核心蛋白可以诱导肝细胞microRNA表达谱发生改变,在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。     

人着色性干皮病基因D对HepG2细胞Mdm2和Mdm4表达的影响

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病基因D（xeroderma pigmentosum D, XPD）对肝癌细胞鼠双微体2（murine double minute 2，Mdm2）和鼠双微体4（murine double minute 4，Mdm4）表达的影响。方法：用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2，实验分为3组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组。用MTT法观察细胞的增殖活力；用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率；用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化。结果：MTT结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了肝癌细胞的增殖活力；流式细胞术结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了G 1期细胞增加，S期减少，凋亡率增加。RT-PCR和Western blotting检测发现，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高，同时使得Mdm2和Mdm4表达降低，P53表达增高。结论：XPD能下调肝癌细胞中Mdm2和Mdm4的表达，上调P53表达，并能抑制肝癌细胞增殖及诱导其凋亡。     

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响*

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因（xeroderma pigmentosum group D, XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2（mitotic arrest deficient 2, MAD2）表达的变化及对细胞增殖的影响。方法：将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组（空白对照组）、脂质体转染HepG2细胞组（脂质体组）、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组（N2 组）和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组（XPD组）。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果：与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,Rb mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低（P<0.05）。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论：XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。     

膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的 探讨膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞的增殖产生的影响。方法 采用Western blotting法鉴定siRNA可有效抑制膜联蛋白A7表达,然后用脂质体转染法将siRNA转染入HepG2细胞,将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,在转染后24h、48h、72h进行细胞计数以绘制细胞增殖曲线,转染后48h进行MTT实验以检测细胞增殖活力;免疫组织化学法检测cyclinD1和Ki67的表达,Western blotting法检测cyclinD1的表达情况。结果 转染了靶向膜联蛋白A7的siRNA后48h的HepG2细胞,细胞计数和MTT实验可见siRNA干扰组细胞增殖活力较阴性对照组和空白对照组显著降低（P<0.05）;cyclinD1和Ki67蛋白表达均为siRNA干扰组细胞表达显著低于两对照组（P<0.05）。 结论 膜联蛋白A7低表达可能对HepG2细胞的增殖具有一定的抑制作用。     

NS-398对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:探讨选择性环氧合酶II(COX-2)抑制剂NS-398对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。方法: 应用MTT法研究不同浓度NS-398对HepG2细胞增殖的影响,DNA梯状电泳(DNA ladder)检测凋亡的发生,流式细胞仪检测细胞周期的改变及凋亡百分率的变化,竞争性RT-PCR检测环氧合酶II COX-2 mRNA及抑凋亡基因bcl-2 mRNA表达的改变。结果: NS-398呈剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖,并诱导其凋亡,细胞周期分析表明随着浓度增大S期细胞明显减少,有G₀/G₁期细胞累积现象,并伴有Bcl-2 mRNA表达的下调,而对COX-2 mRNA表达改变无明显影响,且COX-2表达改变与NS-398引起的HepG2细胞的增殖和凋亡均无相关性(相关系数分别为:r=0.056,P>0.05和r=0.119,P>0.05)。结论: NS-398能明显抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,与细胞G₀/G₁期阻滞以及bcl-2基因表达下调有关,而非依赖于抑制COX-2基因的表达。     

敲低膜联蛋白A7对人肝癌HepG2细胞Bcl-2和Bax表达的影响

目的 探讨敲低膜联蛋白A7表达对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法 将HepG2细胞接种于6孔板,分为3组：siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,其中干扰组只转染靶向膜联蛋白A7的siRNA,阴性对照组只转染阴性对照siRNA,空白对照组只加转染试剂。通过Western blotting鉴定膜联蛋白A7在转染后48h可被最大程度的抑制,于是在转染后48h采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,通过免疫组织化学、Western blotting和RT PCR检测Bcl-2和Bax蛋白及mRNA的表达。 结果 与阴性对照组和空白对照组相比,siRNA干扰组细胞凋亡率显著增高（P<0.05）,Bcl-2蛋白和mRNA的表达均显著降低（P<0.05）,而Bax蛋白和mRNA均未发生显著变化（P>0.05）。结论 敲低膜联蛋白A7可促进HepG2细胞的凋亡,降低Bcl-2和Bax的比值。     

miR-144靶向Bcl-2抑制儿童急性淋巴细胞白血病细胞增殖并促进凋亡的分子机制研究

目的:观察miR-144对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)CEM/C1细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:运用qRT-PCR法和Western blot法检测非恶性血液病患儿脊髓组织(Normal组)、ALL患儿脊髓组织(ALL组)、CEM/C1细胞(CEM/C1组)、ALL癌细胞珠MOLT-4(MOLT-4组)和CCRF-CEM(CCRF-CEM组)中miR-144、Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白表达水平并比较组间差异;将不同质粒以脂质体法转染至CEM/C1细胞,分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-144组(转染miR-144mimics)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC)、miR-144inhibitor组(转染miR-144inhibitor)、si-NC组(转染si-NC)、si-Bcl-2组(转染si-Bcl-2)、miR-144+Vector组(miR-144mimics和pcDNA 3.1共转染)、miR-144+Bcl-2组(miR-144mimics和pcDNA 3.1-Bcl-2共转染),Western blot检测各组细胞中Bcl-2蛋白表达;MTT法检测各组细胞增殖;流式细胞术检测各组细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞的荧光素酶活性。结果:与Normal组相比,ALL组miR-144表达显著降低,Bcl-2mRNA和蛋白表达均显著升高(P0.01)。与CEM/C1组比较,MOLT-4组和CCRF-CEM组miR-144表达显著升高,Bcl-2mRNA和蛋白表达均显著降低(P0.01)。与miR-NC组相比,miR-144组细胞增殖率降低,凋亡率升高,Bcl-2(WT)细胞的荧光活性降低(P0.01)。与si-NC组相比,si-Bcl-2组细胞增殖率降低,凋亡率升高(P0.01)。与miR-144+Vector组相比,miR-144+Bcl-2组细胞增殖率降低,凋亡率升高(P0.01)。结论:miR-144可抑制儿童ALL癌细胞增殖,促进其凋亡,可能与其能靶向Bcl-2有关,或可为儿童ALL治疗提供新的靶点。     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

shRNA沉默HBx下调HepG2.2.15细胞基质金属蛋白酶2的表达

目的探讨HBx小发夹RNA(shRNA)对HepG2.2.15细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响。方法采用psiHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞,反转录PCR评估沉默效率;MTT法检测转染后HepG2.2.15细胞增殖情况;实时定量PCR(qRT-PCR)检测MMP-2 mRNA表达;Western blot法检测MMP-2蛋白表达的变化。结果反转录PCR检测HBx基因的沉默效率为53.6%;MTT检测结果显示转染24、48、72 h后HepG2.2.15细胞的增殖受抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);psiHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞后,qRT-PCR和Western blot检测结果显示,HepG2.2.15细胞中MMP-2基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 RNA干扰技术抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,可抑制细胞增殖,下调HepG2.2.15细胞中MMP-2的表达。     

低表达miR-21对苦参碱诱导的肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-21低表达能否增强苦参碱(matrine,MAT)对肝癌细胞的促凋亡作用。方法:实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测不同浓度MAT作用HepG2细胞后miR-21的表达情况。流式细胞术检测miR-21低表达对MAT诱导的细胞凋亡的影响;RT-qPCR和Western blot检测miR-21低表达对MAT诱导的细胞凋亡中Bc1-2和Bax mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:miR-21表达量随MAT作用浓度的增加而增加;miR-21低表达可促进MAT诱导的细胞凋亡,并促进Bax mRNA和蛋白的表达(P0.05),而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表达(P0.05)。结论:miR-21低表达可通过抑制Bcl-2和促进Bax的表达来增强MAT诱导的HepG2细胞凋亡。     

MicroRNA-29a对大鼠心肌细胞Bcl-2和Mcl-1表达的调控作用及其机制

 目的：探讨microRNA-29a（miR-29a）对大鼠心肌细胞(CM细胞)B细胞白血病/淋巴瘤-2（Bcl-2） 和髓样细胞白血病-1（Mcl-1）表达的调控机制。方法：体外培养新生Sprague-Dawley大鼠CM细胞和人胚肾细胞株293T。合成大鼠miR-29a的拟似物（mimic）和抑制剂（inhibitor）。用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染miR-29a mimic进入CM细胞，转染 48 h后分别用实时荧光定量PCR和Western blotting检测Bcl-2和Mcl-1 mRNA和蛋白的表达变化。构建Bcl-2 和Mcl-1 的萤光素酶报告基因载体（DNA质粒），转染293T 细胞(DNA质粒和miRNA共转染)和CM细胞（miRNA和 DNA 质粒先后转染），双萤光素酶报告基因系统检测萤光素酶的表达变化。结果：CM细胞转染miR-29a mimic 48 h后，Bcl-2 和Mcl-1 mRNA和蛋白的水平均下调（P<0.05）。双萤光素酶报告基因系统显示，在293T细胞中，miR-29a可特异抑制带有 bcl-2和mcl-1 3’UTR上野生型识别元件的报告基因表达（P<0.05），在CM细胞中，抑制内源性的miR-29a水平能促进bcl-2和mcl-1 3’UTR上野生型识别元件的报告基因表达。结论：抗凋亡基因bcl-2和mcl-1是miR-29a的靶基因。miR-29a可能通过作用于Bcl-2和Mcl-1实现对心肌细胞凋亡的调控作用，具体效应仍待进一步阐明。     

miRNA-181b在氧-糖剥夺致N2A细胞缺血损伤中的作用及对热休克蛋白A5表达的调节

目的 探讨miR-181b在氧糖剥夺(OGD)致N2As神经瘤细胞缺血损伤中的作用,及其对热休克蛋白（HSP）A5表达的调节。方法 应用N2A细胞OGD模型模拟神经细胞缺血损伤,MTT比色法检测N2A细胞生存率,免疫印迹法检测HSPA5蛋白表达水平,实时定量PCR法检测miR-181b和HSPA5 mRNA表达水平,荧光素酶报告基因技术检测miR-181b对HSPA5 mRNA的直接调控作用。 结果 miR-181b在OGD致N2A细胞缺血损伤中表达水平明显降低(n=5);在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的生存率(n=6);而在非OGD条件下,miR-181b表达水平的改变对N2A细胞活力无影响;miR-181b表达水平的改变可显著影响HSPA5蛋白表达水平(n=3),而非HSPA5的mRNA水平;共转染miR181b前体（pre-miR-181b）或miR-181b抑制剂（anti-miR-181b）可显著抑制或增高含有HSPA5 mRNA 3’-UTR的荧光素酶报告基因的活性(n=5)。 结论 miR-181b通过负性调节HSPA5的蛋白表达水平,在OGD致N2A神经细胞缺血性损伤中发挥重要作用。     

腺相关病毒介导的PLB基因反义RNA对糖尿病大鼠心肌肌浆网

目的: 构建磷酸受纳蛋白(PLB)反义RNA腺相关病毒载体(rAAV-asPLB),建立糖尿病(DM)大鼠模型。直接心肌注射rAAV-asPLB,观察其对DM大鼠心肌PLB基因转录和蛋白表达的影响,以及对心肌肌浆网Ca²⁺-ATPase活性的作用。方法: 利用质粒辅助重组腺相关病毒系统试剂盒构建rAAV-asPLB。腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导DM大鼠模型,将实验动物分为4组:正常组、DM组、盐水组和rAAV-asPLB组。盐水或rAAV-asPLB注射后6周,RT-PCR检测心肌PLB mRNA转录;Western blotting检测PLB蛋白表达水平;检测心肌肌浆网Ca²⁺-ATPase活性。结果: (1)成功构建rAAV-asPLB,诱导出DM大鼠模型。(2)DM组和盐水组PLB mRNA水平均高于正常组;rAAV-asPLB组PLB mRNA水平较DM组和盐水组明显降低。 (3)DM组和盐水组PLB 蛋白水平均高于正常组;rAAV-asPLB组PLB 蛋白水平较DM组和盐水组明显降低。(4)肌浆网Ca²⁺-ATPase活性在DM组和盐水组中较正常组明显降低,而rAAV-asPLB组较DM组和盐水组升高。结论: rAAV-asPLB抑制DM大鼠心肌PLB表达,增强Ca²⁺-ATPase活性。     

下调microRNA-181b在小鼠缺血性脑损伤中的神经保护作用

目的:探讨microRNA-181b(miR-181b)在缺血性小鼠脑损伤病理过程中的神经保护作用。方法:应用N2A细胞氧-糖剥夺(OGD)模型模拟神经细胞缺血损伤;应用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型模拟缺血性脑损伤(成功率约60%),原位细胞凋亡检测试剂盒检测N2A细胞损伤程度,蛋白印迹检测miR-181b靶蛋白自噬蛋白5(Atg5)及caspase-9的变化情况,萤光素酶报告基因技术检测miR-181b对Atg5 mRNA的直接调控作用。结果:在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的凋亡(P0.05);miR-181b表达水平的改变可显著影响Atg5蛋白表达水平(P0.05);共转染miR-181b前体或miR-181b抑制剂可显著抑制或增高含有Atg5 mRNA 3’-UTR的萤光素酶报告基因的活性(P0.05);MCAO后活化caspase-9的表达显著升高,而miR-181b拮抗剂可使MCAO后剪切的caspase-9表达明显减少(P0.05)。结论:下调miR-181b可能通过调节Atg5的蛋白表达在缺血性小鼠脑损伤中发挥神经保护作用。     

miR-143 down-regulates TLR2 expression in hepatoma cells and inhibits hepatoma cell proliferation and invasion

Hepatoma is a tumor with high degree of malignancy. A number of oncogenes and tumor suppressor genes play certain roles in tumorigenesis and progression. Among which, miRNA, as an important class of gene regulators, play important roles in regulating tumorigenesis and development of hepatoma. So know well the unique molecular pathway is very important. Here, we showed that there is a different miR-143 expression patterns in different hepatoma tissues, and that miR-143 expressions contribute disease progress. By contrast, we down-regulated the expression of miR-143 with miR-143 mimics in HepG2 cells resulting in decreased proliferation. And the decreased proliferations of HepG2 cells were due to a G₀/G₁ arrest of cell cycle. During this progress, the increased apoptosis may be another major cause for decreased proliferation of HepG2 cells. And then, we found miR-143 down-regulation induced decreased mRNA and protein expressions of TLR2 and NF-κB. These results show that HepG2 cells depend to a greater extent on miR-143 for proliferation, and miR-143 down-regulation may induce a cell cycle arrest though TLR and NF-κB pathway. miR-143 blockade may be beneficial in therapy of Hepatoma.     

MicroRNA-100对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响

 目的：探讨microRNA-100(miR-100) 对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响及其可能机制。方法：通过脂质体介导将人工合成的miR-100模拟物及其阴性对照转染人肝癌HepG2细胞,用细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法检测转染后HepG2细胞的增殖活力,用流式细胞术判定细胞周期分布,并进一步用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting分析Polo样激酶1(Plk1)的表达水平。结果：荧光显微镜下观察到经阳离子脂质体介导的细胞转染效率大于85%。转染miR-100模拟物的实验组细胞的增殖抑制率在24、48和72 h分别为(43.5±12.2)%、(46.5±3.7)%和(52.1±0.2)%,均显著高于对照组细胞（P<0.01）,并且在72 h实验组细胞增殖指数（35.8±1.4）低于阴性对照组（39.2±1.0）和单纯脂质体组（40.7±2.0）(P<0.05)。同时与对照组相比,实验组细胞Plk1　mRNA和蛋白表达水平在转染miR-100后 72 h明显降低（P<0.05)。结论：miR-100可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与其下调Plk1的表达有关。