PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段序列分析和比较

目的 分析和比较不同地区中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2区段的基因特征。方法 采用特异性ITS2引物对嗜人按蚊和中华按蚊江苏实验株以及从湖北省和越南现场捕获的嗜人按蚊和中华按蚊进行PCR扩增、克隆并对ITS2区段序列进行分析。结果 嗜人按蚊实验株的ITS2区段序列有452bp，与嗜人按蚊现场株的ITS2区段序列相同，中华按蚊实验株的ITS2区段序列有472bp，与中华按蚊现场株的ITS2区段序列也相同；但嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶位点。结论 可依据中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2基因序列内限制性内切酶切位点不同的基因特征，采用PCR-RFLP技术建立中华按蚊和嗜人按蚊基因鉴别技术。     

PCRRFLP单酶切法鉴别赫坎按蚊复合体的研究

目的建立一种新的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别技术,应用于现场按蚊样本的鉴别。方法用分子生物学软件Vector NTI 9.0,对赫坎按蚊复合体的嗜人按蚊、雷氏按蚊、中华按蚊、八代按蚊4个近缘种按蚊rDNA基因的ITS2区段序列进行限制性内切酶酶切位点预测分析,选择特异性内切酶,建立一种能同时鉴别4种近缘种按蚊的聚合酶链反应限制性片段长度多态(PCR RFLP)单酶切法鉴别技术,并对现场捕获的452只按蚊样本进行基因鉴别。结果软件预测赫坎按蚊复合体近缘种4种按蚊的rDNA基因的ITS2区段可被限制性内切酶Dde I切成大小易于区分的不同片段,PCR RFLP单酶切实验结果和软件预测结果完全吻合。4个疟疾流行区捕获的452只按蚊样本经PCR RFLP Dde I单酶切法鉴定有20只嗜人按蚊、6只雷氏按蚊、391只中华按蚊、35只八代按蚊,与形态学鉴别结果符合率为93.4%,与PCR RFLP双酶切法结果符合率为100%。结论新建立的PCR RFLP Dde I单酶切法基因鉴别技术可准确鉴别赫坎按蚊复合体,比传统的形态学鉴别更为简便、可靠,适合用于复合媒介地区的媒介监测。     

我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究

目的　分析不同地区嗜人按蚊的基因特征。　方法　选择 13种随机引物对嗜人按蚊江苏、广西和四川实验株以及从湖北和广东现场捕获的嗜人按蚊进行随机引物 PCR扩增 ,并以中华按蚊江苏实验株为对照。　结果　 13种随机引物中有 7种随机引物对中华按蚊和 5个地区的嗜人按蚊 PCR扩增的结果存在差别。S-随机引物对中华按蚊和不同地区嗜人按蚊的扩增结果出现明显差异。中华按蚊和不同地区的嗜人按蚊均出现 4 5 0 bp较强扩增条带。但 2 4 0 bp的强扩增条带为中华按蚊所特有。嗜人按蚊江苏和四川实验株分别在 2 30 bp和 32 0 bp处有 1条强扩增条带 ,而从湖北和广东现场采集的嗜人按蚊分别在 4 0 0 bp和 2 6 0 bp处出现较强的扩增条带。　结论　采用随机引物 PCR技术对不同地区嗜人按蚊的基因分析已显示明显差异。已发现的一些特有的 DNA扩增条带可被用作进一步的基因特征分析和鉴别。     

赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究

目的分析不同地区嗜人按蚊的基因特征。方法 选择13种随机引物对嗜人按蚊江西，广西和四川实验株以及从湖北和广东现场捕获的嗜人按蚊进行随机引物PCR扩增，并以中华按蚊江苏实验株为对照。结果 13种随机引物中有7种随机引物对中华按蚊和5个地区的嗜人按蚊PCR扩增的结果存在差别。S－随机引物对中华按蚊和不同地区嗜人按蚊的扩增结果出现明显差异。中华按是方和不同地区的嗜人按蚊均出现450bp较强扩增条带。但240bp的强扩增条带为中华按蚊所特有。嗜人按蚊江苏和四川实验株分别在230bp和320bp处有1条强扩增条带，而从湖北和广东现场采集的嗜人按蚊分别在400bp和260bp处出现较强的扩增条带。结论 采用随机引物PCR技术对不同地区嗜人按蚊的基因分析已显示明显差异。已发现的一些特有的DNA扩增条带可被用作进一步的基因特征分析和鉴别。     

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的 对浙江省传疟媒介种类进行鉴定，以指导疟疾防治工作。方法 针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2（rDNAITS2）区段基因特征，应用PCR基因鉴别技术，对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果 浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp，与实验室中华按蚊标本一致。结论 中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介，现场调查未发现嗜人按蚊。     

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术，对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增，并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较，现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。     

我国雷氏按蚊和嗜人按蚊的分子鉴别和分类地位的探讨

[目的 ]论证我国雷氏按蚊与嗜人按蚊的分类地位。 [方法 ]采用分子鉴别法 (鉴别PCR和rDNA ITS2序列 )检测辽宁及山东两省现场按蚊标本 ,并依据ITS2区序列建立分子系统树。 [结果 ]分子鉴别显示 ,辽宁和山东两省均存在雷氏按蚊和嗜人按蚊。我国雷氏按蚊 (辽宁和山东省 ,n =6 )和嗜人按蚊 (辽宁、云南、河南和四川省 ,n =10 )ITS2序列长度和GC含量分别为 45 1bp、 46 2 % ,44 8bp、 46 0 % ;各地雷氏按蚊和嗜人按蚊序列均无差异 ,但各地嗜人按蚊与对照组江苏的嗜人按蚊相比 ,种内序列差异为 0 88% ;雷氏按蚊与嗜人按蚊种间序列差异为 2 5 7%。分子系统树显示雷氏按蚊与中华按蚊、嗜人按蚊与凉山按蚊亲缘关系较近。 [结论 ]根据分子鉴别 ,确认我国雷氏按蚊与嗜人按蚊为同域分布的 2个独立种     

PCR-RFLP鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的　建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法—PCR产物酶切片段长度多态性分析 (PCR RFLP)。　方法　用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA ,PCR特异扩增核糖体 2 8S第 3结构域 (D3 )基因 ,对PCR产物进行纯化、克隆和测序 ;分析微小按蚊A和CD3基因的酶切图谱 ,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割 ,按照酶切片段长度区分两亲缘种。　结果　微小按蚊A被限制性内切酶MboII切割后在约 3 76bp、2 68bp和 10 8bp处出现 3条条带 ,而微小按蚊C因第 96bp、97bp位点突变 ,不存在限制性内切酶MboII的特异识别位点而未被消化 ,仅在 3 76bp处存在唯一条带。　 结论　本实验建立的PCR RFLP分子鉴别方法能有效地将形态难以鉴别的微小按蚊亲缘种A和C(GenBank :AF416782 ,AF415 5 94)区分开来。     

一种简便的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别新技术

目的 建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内不同近缘种按蚊的基因鉴别技术。方法 依据赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊ITS2区段的基因序列特征设计特异性引物，建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊的简便的PCR基因鉴别技术，并采用传统的形态学分类方法和新建立的基因鉴别技术对从辽宁、河南省以及在朝鲜现场捕获的按蚊分别进行了形态学和基因鉴别及比较。结果与结论 新建立的基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊。具有比传统的形态学分类方法准确，比已有的PCR-RFLP蚊种基因鉴别技术更简便、价廉和省时的特点。适用于不同的复合媒介地区的疟疾媒介调查和监测。     

随机引物聚合酶链反应用于鉴别嗜人按蚊不同地理株的初步研究

目的探讨嗜人按蚊是否存在亚种（或地理株）。方法应用随机引物聚合酶链反应技术（ＲＰ－ＰＣＲ），选用３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株、广东株的ＤＮＡ扩增片段进行分析并以中华按蚊江苏株作对照。结果中华按蚊和嗜人按蚊的扩增条带存在明显差别，３种引物对嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株的扩增图谱均存在明显差异。结论 ＲＰ－ＰＣＲ显示嗜人按蚊江苏株、广西株和广东株之间存在差异，但这种差异在嗜人按蚊种或种下分类上的意义有待进一步分析。     

不同地区微小按蚊rDNA-ITS2序列差异

目的　比较我国云南、海南省、广西壮族自治区及泰国等不同地区微小按蚊核糖体 DNA第 2内转录间隔区 ITS2 )序列差异。　方法　取单只雌蚊蚊腿消化提取 DNA,PCR特异扩增 r DNA- ITS2片段 ,并对其扩增产物纯化、测序及分析。　结果　发现 2种不同的 ITS2序列 Gen Bank登录号 :AF4 16 783,AF4 16 784 ) ,分别与微小按蚊 A和 C同源 ,ITS2序列长度及 GC含量分别为 4 81bp,5 4 .0 4 %和 4 83bp,5 4 .2 3% ,两者无显著性差异 ;但 2 2个固定位点存在碱基置换和插入 /缺失 ,序列差异为 5 .8%。　结论　研究区内微小按蚊存在 A和 C两个不同的亲缘种