肿瘤细胞节律基因对其药物敏感性的影响

目的 通过体外实验诱导节律基因表达,探讨肿瘤细胞节律基因对其药物敏感性的影响.方法 采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)诱导体外培养的EMT6乳腺癌细胞节律基因的表达;在不同时间点,以RT-PCR检测节律基因的代表mPer1基因的表达水平.在mPer1基因表达的高峰与低谷分别给予阿霉素(ADM)处理.采用二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝(MTT)法和流式细胞术检测ADM对EMT6细胞增殖的影响.结果 PMA诱导后,EMT6细胞的mPer1基因呈近日节律.在mPer1基因表达高峰时,ADM对肿瘤细胞的抑制率高于其在低谷的抑制率.结论 肿瘤细胞节律基因能够影响其对药物的敏感性.     

Effects of Simulated Microgravity on Clock and Bmal1 Gene Expression in NIH-3 T3 Cells

目的 探讨模拟微重力对NIH-3T3细胞节律基因clock与bmal1 mRNA表达的影响.方法 NIH-3T3细胞采用回转器分别回转培养6h,12 h,18h,24 h,30 h,36 h,42 h和48 h,同时设置1G静置培养为对照组.Trizol试剂提取细胞总RNA,实时定量PCR法检测节律基因clock及bmal1 mRNA在各时间点的相对表达量.通过余弦法获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律.结果 clock及bmal1基因mRNA的表达趋势相近.对照组clock与bmal1 mRNA相对水平呈现节律性表达,而回转组表达无节律性.回转组mRNA相对水平最大值出现于约6h时间点,最小值出现在约18h,而对照组分别出现于约18 h与24 h.与对照组比回转组的周期延长了约16 h.回转后clock与bmal1的峰值相位前移.结论 NIH-3T3细胞中clock与bmal1的表达存在同步化的转录特征.模拟微重力可影响clock与bmal1节律的周期长度及峰值相位.     

模拟微重力对NIH-3T3细胞clock及bmal1基因表达的影响

目的探讨模拟微重力对NIH-3T3细胞节律基因clock与bmal1 mRNA表达的影响。方法 NIH-3T3细胞采用回转器分别回转培养6 h,12 h,18 h,24 h,30 h,36 h,42 h和48 h,同时设置1 G静置培养为对照组。Trizol试剂提取细胞总RNA,实时定量PCR法检测节律基因clock及bmal1 mRNA在各时间点的相对表达量。通过余弦法获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果 clock及bmal1基因mRNA的表达趋势相近。对照组clock与bmal1 mRNA相对水平呈现节律性表达,而回转组表达无节律性。回转组mRNA相对水平最大值出现于约6 h时间点,最小值出现在约18 h,而对照组分别出现于约18 h与24 h。与对照组比回转组的周期延长了约16 h。回转后clock与bmal1的峰值相位前移。结论 NIH-3T3细胞中clock与bmal1的表达存在同步化的转录特征。模拟微重力可影响clock与bmal1节律的周期长度及峰值相位。     

穿膜肽mCLOCK's DNA-BIND作为药物载体的生物安全性初步评价

目的 研究一种新的来源于节律蛋白mCLOCK's DNA结合域的穿膜肽mCLOCK's DNA-BIND(CDB)作为药物携带载体的生物安全性.方法 化学合成穿膜肽CDB.体外采用Phorbol 12-Myristate 13-acetate(PMA)诱导NIH3T3细胞的近日节律.于诱导后不同时间点,CDB与小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞共孵育,RT-PCR检测其对近日节律核心分子mPeriod1(mPer1)基因表达的影响.此外,培养的NIH3T3直接与CDB共孵育12 h和24 h后,MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测其对细胞周期和凋亡的作用.结果 CDB没有明显影响PMA诱导的mPer1节律基因表达.此外,CDB不干扰NIH3T3细胞增殖及生长周期,亦无明显的诱导凋亡作用.结论 CDB对细胞近日节律、细胞增殖、生长周期及细胞凋亡均无明显毒副效应,可望作为一种安全有效药物载体,并具有广泛的临床应用前景.     

节律基因mPeriod2对Lewis肺癌细胞生长的影响

目的 研究节律基因mPeriod2(mPer2)对肿瘤细胞的生长抑制及诱导分化凋亡的作用。方法 体外培养Lewis肺癌细胞,使用脂质体包裹法将真核表达质粒pcDNA3．1为基础的mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转导入Lewis肺癌细胞内;以免疫组化及流式细胞技术检测mPer2表达;通过流式细胞技术检测稳定转染的mPer2阳性表达的Lewis肺癌细胞的生长及凋亡。结果 mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转染的Lewis肺癌细胞表达PERIOD2蛋白;与对照组比较,其增殖指数下降及凋亡率增加。结论 节律基因mPer2可以抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。     

吗啡依赖及戒断小鼠脑内节律基因mPeriodl表达的研究

目的 研究吗啡依赖和吗啡戒断小鼠脑组织内节律基因mPeriod1（mPer1）表达的变化。方法 以雄性BALB／C小鼠的吗啡条件性位置偏爱为指标，观测吗啡依赖组、吗啡戒断组小鼠与正常盐水组小鼠的药物精神依赖的变化；应用免疫组化SP法检测3组小鼠脑内mPer1的表达情况；利用图像软件对免疫组化结果进行分析和处理。结果 吗啡依赖组的小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组有明显改变。而吗啡戒断组小鼠脑内mPerl表达峰值相位较正常盐水组没有显著性差异。结论 研究结果表明吗啡成瘾影响了以mPer1为重要部件的近日钟的自激振荡过程，使近日节律发生了改变。     

节律基因mClock在肿瘤实验化疗中的作用

目的 研究节律基因mClock在顺铂诱导小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)凋亡中的作用.方法 体外采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)诱导LLC细胞近日节律,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测细胞mClock基因的节律性表达.于诱导后不同时间点,顺铂(CDDP)处理细胞,24 h后四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)法和流式细胞术检测(FCM)其对细胞的增殖与凋亡的影响.采用脂质体介导方法将mClock基因转染至LLC细胞,顺铂处理细胞,24 h后MTT法和流式细胞术检测其对细胞的增殖与凋亡的影响.结果 PMA作用LLC后,mClock基因呈现节律性表达.PMA诱导LLC节律表达的不同时间点,细胞对顺铂的敏感性不同.mClock过表达使顺铂作用后LLC凋亡率下降,细胞增殖明显.结论 mClock能够抑制顺铂诱导LLC的凋亡.     

黄芪的含药血清诱导K562细胞表达^Gγ-mRNA和合成HbF

目的研究黄芪对K562细胞的^Gγ-珠蛋白基因表达的作用。方法以K562细胞为体外模型，用联苯胺染色方法来确定黄芪的含药血清诱导K562细胞向红系分化的作用；用RT—PCR方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白mRNA的表达；用Western Blot方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞HbF的合成。结果黄芪的含药血清作用于K562细胞5d后联苯胺染色阳性率达19．8％；同时伴有^Gγ-珠蛋白mRNA的表达的增加（最高可达3．6倍）和HbF的合成的增加，与丁酸钠组比较，黄芪组诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白基因mRNA的表达可以持续3～5d，而丁酸钠组只有1d。结论黄芪有望成为一种有效的γ蛋白基因诱导剂。     

吗啡依赖及戒断小鼠脑内节律基因mPeriod1表达的研究

目的研究吗啡依赖和吗啡戒断小鼠脑组织内节律基因mPeriod1(mPer1)表达的变化。方法以雄性BALB/C小鼠的吗啡条件性位置偏爱为指标,观测吗啡依赖组、吗啡戒断组小鼠与正常盐水组小鼠的药物精神依赖的变化;应用免疫组化SP法检测3组小鼠脑内mPer1的表达情况;利用图像软件对免疫组化结果进行分析和处理。结果吗啡依赖组的小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组有明显改变。而吗啡戒断组小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组没有显著性差异。结论研究结果表明吗啡成瘾影响了以mPer1为重要部件的近日钟的自激振荡过程,使近日节律发生了改变。     

节律基因Period2对肿瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的探讨Period2（Per2）基因对细胞生长及放射敏感性的影响。方法体外培养C6神经胶质瘤细胞（C6 glioma cells）,使用脂质体包裹法将nr2表达质粒（pcDNA3．1-Per2）转导入C6细胞内;以免疫组化及流式细胞术检测Per2表达;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的C6细胞在正常情况下和γ射线照射后的凋亡、生长。结果未经γ射线照射的Per2阳性表达的C6细胞较对照组细胞增殖减慢、凋亡率增加,但γ射线照射后的较对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少。结论节律基因Per2过表达会增加肿瘤细胞的凋亡,但在射线照射情况下会降低肿瘤细胞对射线的敏感性。     

大鼠腹腔巨噬细胞表达促肾上腺皮质激素释放激素的实验研究

目的 观察促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)在大鼠腹腔巨噬细胞的表达变化规律.方法 体外培养大鼠腹腔巨噬细胞,采用RT-PCR及ELISA技术检测正常及脂多糖(LPS)、佛波脂(PMA)刺激后,细胞CRH mRNA转录水平及CRH多肽合成水平.结果 RT-PCR结果显示,正常大鼠腹腔巨噬细胞内有一定水平的CRH mRNA,LPS及PMA刺激后,细胞内CRH mRNA水平均显著增高(P＜0.01).在多肽水平,正常大鼠腹腔巨噬细胞可表达低水平的CRH[约(0.07±0.01)ng/107cells],LPS及PMA促进了CRH多肽的合成(P＜0.01).结论 正常大鼠腹腔巨噬细胞可合成表达CRH,其水平在活化后大鼠腹腔巨噬细胞显著上调.     

Estimating time of death based on the biological clock

The biological clock may stop at the time of death in a dead body. Therefore, the biological clock seems useful for estimating the time of death. In this study, we tried to read the biological clock in tissues from dead bodies to estimate the time of death using molecular biological techniques. At first, we examined real-time RT-PCR analysis of gene expression for mPer2 and mBmal1, which constitutes a feedback loop in the oscillation system, in the kidney, liver, and heart of mice. We could detect circadian oscillation of these gene expressions in mouse tissues even at <48 h after death. Thus, the ratio of mPer2/mBmal1 was found to be useful for estimating the time of death. We next applied this method to the liver, kidney, and heart obtained from forensic autopsy cases with less than 72 h of postmortem interval. Significant circadian oscillation of hPer2/hBmal1 ratio could be detected in these autopsy samples. We further examined gene expression for hRev-Erbα, a component of another feedback loop. The ratios of hRev-Erbα/hBmal1 showed higher amplitude of oscillation than those of hPer2/hBmal1 and are considered more suitable for estimating the time of death. In particular, a hRev/hBmal1 ratio of >50 indicated the time of death as 0200–0900 hours, and a hRev/hBmal1 ratio that considerably exceeded 75 indicated the time of death as 0200–0800 hours. On the other hand, a hRev/hBmal1 ratio of less than 25 strongly indicated the time of death as 1000–2300 hours. Taken together, these findings indicate that gene expression analyses of the biological clock could be powerful methods for estimation of the time of death.     

环指蛋白187过表达后对人脑胶质瘤细胞U87的影响

 目的 探究环指蛋白187(ring finger protein 187,RNF187)过表达后对人脑胶质瘤细胞U87的影响及其可能机制。方法 体外培养胶质瘤细胞系U87,转染过表达RNF187入U87细胞,对比分析RNF187 过表达对肿瘤细胞生长增殖能力、细胞干性和体外侵袭及转移能力;最后通过检测RNF187及焦亡标志物,即炎性小体3(inflammasome3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、GSDMD和GSDME的表达,明确RNF187与焦亡的关系。结果 CCK-8、细胞克隆和Transwell 实验证实,RNF187过表达后U87细胞形态上肿胀肿大,且细胞增殖和侵袭能力较对照组增强,RNF187过表达组细胞增殖率(2.24±0.16)高于其他两组;RT-PCR和Western blot实验表明,RNF187过表达后焦亡相关标志物(NLRP3、ASC、GSDMD、GSDME)表达水平较对照组升高(P＜0.05)。结论 RNF187在胶质瘤细胞表达增多,增加胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,可能是通过促进焦亡实现的。     

HIF-1α对人脑胶质瘤SHG44细胞恶性度的影响及其机制

 目的 探究过表达低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)对人脑胶质瘤SHG44细胞恶性度的影响及其可能机制。方法 体外培养SHG44细胞,转染过表达HIF-1α入SHG44细胞,评估HIF-1α转染效率;对比分析HIF-1α过表达对SHG44细胞的增殖、干性、迁移和侵袭的影响;ELISA法检测肿瘤相关炎性反应因子(TNF-α,IL-10,IL-17和IL-1β),Western blot检测SHG44细胞焦亡相关蛋白[炎性小体3(inflammasome3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、GSDMD、GSDME和转化生长因子-β₁(transforming growth factor-β₁,TGF-β₁)]的表达,明确HIF-1α对焦亡的关系。结果 HIF-1α过表达后SHG44细胞明显肿胀增多,细胞的增殖、干性、迁移和侵袭能力较对照组明显增强,与对照组相比肿瘤炎性因子(TNFα,IL-10和IL-1β)表达水平均明显升高,而肿瘤炎性反应抑制因子IL-17表达水平明显下降;HIF-1α过表达后焦亡相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDME和TGF-β₁)表达明显上调(P<0.05)。结论 HIF-1α过表达可能通过促进焦亡提高SHG44细胞的增殖、干性、迁移和侵袭能力。     

碘125治疗裸鼠胶质瘤的实验研究

目的:通过建立裸鼠右肩皮下C6胶质瘤动物模型,研究碘125间质内照射对恶性胶质瘤的治疗作用。方法:Balb/c裸鼠30只。体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,接种于裸鼠右肩皮下建立肿瘤模型。肿瘤形成后对照组(15只),注入无碘125材料,治疗组(15只)肿瘤中心注入碘125聚胺酯放射材料,4周时对比两组肿瘤体积、瘤重并处死取病理行组织学检查分析。结果:C6细胞接种后1周,裸鼠皮下均可见肿瘤形成。4周时对照组与治疗组肿瘤体积、瘤重差异明显(P<0.05),病理组织学检查见对照组肿瘤细胞呈典型的恶性星形细胞瘤特征,治疗组肿瘤细胞体积缩小及大量坏死。结论:碘125聚胺酯放射材料可通过间质内照射对C6胶质瘤细胞产生杀伤作用,明显抑制肿瘤生长。     

内皮素-1对肺组织成纤维细胞上内皮素受体基因表达的影响

 目的 探讨肺组织成纤维细胞中内皮素-1对内皮素受体A-mRNA的表达的影响.方法 用内皮素-1刺激培养的肺组织成纤维细胞,利用反转录PER的方法测定其受体A-raRNA的表达.结果 发现ET-1刺激后出现受体表达下调现象.结论 此现象可能是机体本身自我调节的代偿机制.