活体染料CFDA-SE在淋巴细胞增殖研究中的应用

目的 :探讨活体染料CFDA SE在淋巴细胞增殖研究中的应用价值。方法 :利用CFDA SE染色、荧光抗体标记和流式细胞术 ,检测淋巴细胞及其亚群在多克隆刺激剂作用下荧光强度的变化 ,并应用相关软件分析其增殖情况。结果 :PDB ion omycin或ConA刺激 4 8h后均出现淋巴细胞分裂 ,表现为CFSE荧光强度的系列减半。环孢菌素A(CsA)可抑制ConA促进淋巴细胞增殖的作用 ,CFSE荧光无减半。ConA刺激4 8h后 ,出现CD4 T细胞和CD8 T细胞增殖不同步的现象 ,72h后这一现象更加明显。经ModFitTM 软件拟合后 ,得到的各项增殖指标显示 ,ConA对CD8 T细胞的促增殖作用强于对CD4 T细胞的作用。结论 :CFDA SE染色结合荧光抗体标记和流式细胞术 ,是分析淋巴细胞增殖的有力工具     

耐受性CD8~+ NKT细胞体外增殖能力的鉴定

目的:利用CFSE标记细胞,流式细胞术(FCM)检测法,解析超抗原SEB活化的耐受性CD8+ NKT细胞在体外增殖的情况。方法:利用CFSE标记新鲜分离的C57BL/J鼠脾细胞,分别与ConA和LPS共同培养3d,收集细胞进行荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69分子的表达率和增殖能力。CFSE标记的鼠脾细胞与SEB共培养5d和10d后,荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69的百分数和增殖能力。SEB活化的第10天细胞经CFSE标记后在IL-2的协同作用下继续培养10d,荧光染色,FCM解析这群细胞的增殖能力、活性分子CD69的表达率和NKT细胞亚群的变化情况。结果:ConA、LPS和SEB三者均可以刺激小鼠脾细胞增殖。ConA和LPS在3d内可以使细胞增殖3代,且CD69的表达率为74.19%和41.56%;SEB在5d和10d内分别可以使细胞增殖5代和7代,细胞表面CD69的表达率为32.09%和48.66%。SEB活化的10d细胞可以在IL-2的协同下继续传代培养10d,可以增殖7代;这群细胞中CD8+ NKT细胞亚群,由原始的0.36%增加到38.58%;细胞表面CD69分子由正常值的0.11%提高到83.74%。结论:超抗原SEB活化的CD8+ NKT细胞可以在体外进行增殖培养,且这些细胞是活性化的细胞。利用CFSE标记细胞,FCM可以检测耐受性CD8+ NKT细胞在体外的增殖水平。     

CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立

目的:以流式细胞术(FCM)检测马传染性贫血病毒(EIAV)抗原特异性的T淋巴细胞增殖.方法:将新鲜分离的马外周血单个核细胞(PBMC)进行CFSE 染色, 经纯化病毒体外刺激并培养5 d后, 进行T淋巴细胞亚型标记, 检测特异性增殖的CD4 和CD8 细胞比例.结果:对马PBMC的染色浓度、特异性刺激物的种类及反应时间等条件进行了优化.可对马外周血抗原特异性T淋巴细胞不同亚型的增殖水平进行定量评价 .结论:FCM检测方法为研究马传染性贫血病毒疫苗免疫保护机制提供了一个有效的手段; 该法也可以为其他病毒的免疫学研究提供借鉴.     

流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应

目的探讨应用流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE检测T淋巴细胞各亚群增殖反应的方法学。方法人外周血单个核细胞（PBMC）经CFSE染色后,分别用植物凝血素（PHA）、CD3 mAb和结核杆菌抗原（Mtb-Ag）刺激,加IL-2扩增后,用流式细胞术检测活化增殖后T细胞各亚群的比例,并用ModFit软件分析各亚群的增殖动力模型。结果PHA和CD3 mAb主要活化总T细胞,CD8^＋T细胞的增殖优于CD4^＋T细胞,但CD4^＋T细胞前4代细胞明显多于CD8^＋T细胞。Mtb-Ag主要刺激γδT细胞增殖。结论以CFSE标记淋巴细胞,结合流式细胞术可有效检测出不同T细胞亚群对不同刺激剂的增殖反应以及增殖动力学变化。     

DNA作为一种特异性刺激剂刺激淋巴细胞增殖的研究

目的为了探讨质粒DNA体外刺激淋巴细胞的增殖状况,建立了一种方便可靠的评价豚鼠细胞免疫水平的试验方法。方法用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色豚鼠全血,经植物血凝素(PHA)和质粒DNA刺激培养,利用流式细胞术分析细胞的增殖状况。结果豚鼠全血经PHA和DNA刺激,淋巴细胞增殖能力不同;未免疫组经DNA和PHA刺激后增殖的差异显著,免疫组差异不显著。DNA质粒在体内外均可作为刺激源刺激淋巴细胞增殖。结论建立了一种基于活细胞染料CFSE染色的豚鼠全血淋巴细胞增殖试验方法,可方便、快速、有效地评价细胞免疫水平。     

三七提取物对小鼠淋巴细胞活化、增殖和腹腔巨噬细胞产生NO的影响

目的 分析三七提取物（SE）对小鼠淋巴细胞体外活化、增殖以及对巨噬细胞产生NO的影响，探讨其免疫抑制作用的机制。方法 以多克隆刺激剂刀豆蛋白A（ConA）刺激淋巴细胞活化和增殖，利用荧光标记的单克隆抗体双染技术和流式细胞术检测SE对小鼠CD3^＋T细胞CD69表达的影响；通过CFSE染色流式细胞术检测SE对淋巴细胞增殖的影响；用脂多糖（LPS）或淋巴细胞培养上清液（lymphocytes culture supernate，LCS）体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO，采用Griess试剂盒检测NO的水平。结果 在ConA刺激6h后小鼠T细胞活化率为59．79％，50、100μg／ml的SE可显著降低其活化率，分别为46．50％和37．73％（P〈0．01）。在培养72h后，不同浓度SE能明显抑制ConA诱导T细胞的增殖。SE在12．5～100μg／ml的浓度范围内对淋巴细胞培养上清和LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放具有抑制作用（P〈0．01）。结论 三七提取物对小鼠淋巴细胞的活化、增殖有明显抑制作用，并能抑制巨噬细胞产生NO（P〈0．01）。     

STUDY ON PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELL(PBMC) PROLIFERATIVE RESPONSES TO DIFFERENT HCV ANTIGENS IN PATIENTS WITH HEPATITIS C

为探讨丙型肝炎(HC)病人细胞免疫功能和丙型肝炎病毒(HCV)的致病机制及机体对其免疫保护作用,收集24例HC病人(急性3例,慢性21例),用3H-TdR掺入法研究病人外周血单个核细胞(PBMC)对不同HCV抗原增殖反应,并用流式细胞仪(FACS)检测了PBMC中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群在HCV抗原刺激后的变化.结果:HC病人PBMC对HCV合成肽CP9,NS和基因重组抗原C,E1,E2,NS3刺激后出现不同程度增殖反应,刺激指数(SI)分别为1.69±0.51,1.61±0.54,1.68±0.58,1.49士0.44,1.44±0.44和1.33±0.33.3例急性HC中2例病人的PBMC对HCV抗原呈有效增殖反应(SI≥2.1),且血清HCVRNA阴转伴ALT正常.细胞表型分析显示:增殖的细胞表型是CD4+淋巴细胞,而CD8+淋巴细胞增殖反应较弱.结论:HC病人PBMC确实存在对HCV抗原的增殖反应;CD4+淋巴细胞比CD8+淋巴细胞增殖反应要强,急性HC病人PBMC对HCV抗原有效的增殖反应预示可能有良好的临床愈合.     

紫杉醇对小鼠T细胞的影响

为研究抗癌药紫杉醇(PTX)对T细胞行为的影响及其分子机制,利用流式细胞术分析多克隆刺激剂ConA刺激下T细胞行为:羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记技术分析T细胞增殖相关指数;碘化丙锭染色分析细胞周期分布;AnnexinV-PI染色检测T细胞凋亡;荧光标记的单克隆抗体染色检测T细胞活化表达CD25的百分率。结果显示.PTX对ConA刺激下小鼠T细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。该浓度范围PTX阻滞T细胞于G2/M期,诱导凋亡及抑制CD25表达。25nmol/L的PTX与10nmol/L的环孢素A(CsA)具有明显的协同抑制效应。以上结果表明PTX可明显抑制多克隆刺激剂ConA诱导的T细胞体外增殖,是G2/M期阻滞、凋亡诱导和CD25表达抑制等多种机制共同作用的结果。     

橙皮素对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响

目的:研究橙皮素(Hes)对小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,并探讨其作用机制.方法:用ConA刺激小鼠淋巴结来源的淋巴细胞,以不同终浓度Hes与T细胞共培养,利用荧光标记抗体双染色结合流式细胞术(FCM),检测各药物浓度Hes对ConA诱导的小鼠T细胞表达早期活化抗原CD69的作用;以酶标仪结合MTT比色法检测Hes药物的细胞毒性和对ConA诱导的小鼠淋巴结来源的淋巴细胞增殖的影响;以羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色结合FCM检测Hes对ConA诱导的小鼠T细胞增殖的作用,并应用ModFit软件分析其增殖指数(PI).结果:淋巴细胞的存活率说明0.2 mL/L DMSO和25～75 μmol/L范围内的Hes对小鼠T淋巴细胞无毒副作用;MTT法、CFDA-SE法、双抗体染色法检测Hes对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞的增殖和活化结果均显示,终浓度为25、50、75 μmol/L的Hes对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞的增殖和活化均有抑制作用且呈剂量依赖关系.结论:有望通过进一步的研究将Hes发展为免疫抑制药物.     

双氢青蒿素对小鼠T细胞的免疫抑制作用

目的:研究双氢青蒿素(DHA)在体外对ConA诱导的小鼠T细胞增殖的影响,探讨其可能的免疫作用机制。方法:加入不同浓度DHA,以多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)诱导T细胞活化增殖,用羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色法分析T细胞增殖情况;利用流式细胞术(FCM)结合双色免疫荧光染色技术检测CD3+T细胞早、中、晚期活化标志CD69、CD25、CD71表达情况;用Fluo-4/AM荧光钙离子探针技术检测细胞内钙离子([Ca2+]i)浓度的变化;以碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期分布;运用流式细胞术(FCM)结合三色荧光染色技术检测CD4+CD25highTreg早期活化抗原CD69表达情况。结果:CFDA-SE染色结果显示,DHA能有效抑制ConA诱导的T细胞增殖,并呈时间-剂量依赖性;DHA对ConA刺激的CD3+T细胞CD69、CD25的表达有促进作用,而对CD71的表达有抑制作用,均呈剂量依赖性;DHA单独作用不能引起T细胞[Ca2+]i的升高,在ConA的刺激下能引起[Ca2+]i浓度升高;PI染色流式分析结果显示,DHA阻滞细胞于G0/G1期,阻止细胞进入S期和G2/M期;DHA能够下调CD4+CD25highTreg细胞CD69的表达。结论:DHA对小鼠淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用,是一种潜在的免疫抑制剂。