超声微泡介导pEGFP-N1质粒转染人牙周膜成纤维细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下,介导质粒pEGFP-N1转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的效率及安全性.方法 体外原代培养HPDLFs,以EGFP基因为报告基因,脂质微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染HPDLFs.实验组超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成不同亚组,对照组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和脂质体+质粒组.转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP表达.同时用MTT法检测HPDLFs的活力.结果 超声微泡介导的质粒对HPDLFs的转染效率与脂质体介导的质粒转染效率相似,明显高于其他对照组.超声+微泡+质粒组中HPDLFs的活力明显高于脂质体+质粒组.结论 在一定条件下,超声微泡能安全、有效地介导外源基因的转染与表达.     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。     

超声微泡造影剂介导EGFP对兔视网膜的转染效率

目的 探讨在不同能量超声和一定剂量微泡作用下,超声微泡造影剂介导下增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒对兔视网膜转染的效率、安全性以及可行性.方法 将30只新西兰大白兔随机分为6组:质粒组(A组)、质粒+微泡组(B组)、质粒+超声照射组①(C组)、质粒+超声照射组②(D组)、质粒+微泡+超声照射组①(E组)、质粒+微泡+超声照射组②(F组).将1 ml pEGFP-C1质粒与1 ml SonoVue微泡造影剂混合,由耳缘静脉注入,分别用0.5、1.0 W/cm2超声波辐照眼球.转染7天后行视网膜光镜及透射电镜检查,观察质粒、微泡及超声照射对视网膜有无损害,并在荧光显微镜下观察pEGFP-C1质粒表达情况.结果 光镜及透射电镜结果显示质粒、微泡及超声照射对视网膜无损害.A～D组均可见少量绿色荧光表达(P均＞0.05),E、F组的荧光表达较强,明显高于其他4组(P均＜0.05),E、F组荧光强度差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 在一定能量的超声照射下,超声微泡造影剂能够提高携带EGFP质粒在兔视网膜的转染效率.     

超声微泡介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤细胞与传统转染方法效率对比

目的探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下，介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性。 方法将RB细胞分为6组，1组以一定能量的超声波辐照，2组加适当剂量的微泡造影剂，3组加入质粒，4组加入质粒与微泡，5组加入质粒、微泡，并用一定能量的超声辐照，6组予脂质体与质粒。转染24-48h后观察EGFP表达，并用RT—PCR进行检测。同时对1、2组予以染色。 结果超声微泡介导的DNA质粒对RB细胞的转染效率，与脂质体介导的质粒转染效率相似，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对RB细胞的活性无明显抑制。 结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

超声微泡造影剂介导PEDF基因转染大鼠视网膜与传统转染比较的实验研究

目的探讨超声微泡造影剂与脂质体介导色素上皮源性因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管（choroidal neovascu larization,CNV）效果。方法氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型。将36只CNV大鼠分为3组：（1）空白组,（2）超声辐照微泡转染组,（3）脂质体转染组。于转染后7、14、28d,分别进行荧光眼底血管造影（fundus flourascent angiography,FFA）,RT-PCR检测。结果转染后7、14d超声微泡介导PEDF质粒对大鼠视网膜的转染效率与脂质体介导的转染效率相似,但转染后28d两者转染效率差异有显著性。超声微泡与脂质体介导PEDF质粒转染对CNV有抑制作用。结论利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用。     

超声微泡造影剂介导PEDF质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管(CNV)效果.方法 氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型.将24只造模成功的CNV大鼠分为2组:①空白组,②超声辐照微泡转染组.于转染后14 d,分别进行眼底荧光血管造影(FFA),RT-PCR和免疫荧光检查.结果 转染后14天超声微泡能介导PEDF质粒对大鼠视网膜、脉络膜的转染,并且对CNV有抑制作用.结论 利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜、脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用.     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。