CD3／抗CD20双特异双链抗体生物学活性研究

目的 研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性。方法 采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用^3H-TdR掺入实验和^51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质。结果 纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3^ )和Daudi细胞（CD20^ )的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促进丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的自学成才性。结论 抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和H147相同的性质。且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体。     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体的生物学活性研究

目的　研究抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体介导的特异性靶向杀伤活性。方法　采用亲和层析法分离纯化本室构建的抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体可溶性表达产物 ,并用SDS PAGE、Westernblot及抗活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物 ;采用51 Cr释放试验测定其介导的体外靶向杀伤活性。结果　纯化的抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体具有与Jurkat细胞 (CD3 )和K5 6 2 A0 2 (Pgp )细胞结合的活性 ;抗Pgp 抗CD3双特异双链抗体具有介导激活的T淋巴细胞杀伤Pgp表达阳性的耐药肿瘤细胞的作用 ,杀伤作用的强弱显示出效靶比和剂量依赖关系 ,且可被CD3ScFv或PgpScFv特异性的阻断。结论　抗Pgp 抗CD3微型双功能抗体有望成为治疗耐药肿瘤 ,特别是肿瘤残留灶和微小转移灶的治疗的一种新策略。     

抗人CD138单克隆抗体以及重组双特异性抗体的开发及应用

目的制备鼠源抗人CD138单克隆抗体,经Western blot验证后,利用其基因序列构建重组抗人CD138抗体以及一种能够同时靶向CD138分子和CD3分子的双特异性抗体并对其功能进行验证。方法通过杂交瘤技术获得鼠源抗人CD138抗体,分子克隆构建重组抗体,Protein A纯化,综合运用Western blot(WB)、Flow cytometry(FC)、ELISA等实验方法进行相关的功能验证。结果鼠源的CD138单克隆抗体特异性强,可用于后续重组抗体的制备,而且重组的抗人CD138单克隆抗体经流式验证,同样可以与表达CD138的肿瘤细胞系(RPMI-8226,U266)进行结合,且不与CD138-的肿瘤细胞系(Jurkat)结合,在此基础上构建的双特异性抗体经功能验证,可以激活T细胞,从而对CD138+的细胞系进行特异杀伤。结论基于鼠源单克隆抗体重组构建表达的双特异性抗体anti-CD138×CD3具有靶向杀伤骨髓瘤细胞的生物活性,为细胞免疫治疗骨髓瘤疾病提供了临床研究基础。     

免疫亲和层析法纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体

目的：制备可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱。方法：纯化的抗抗CD3ScFv单克隆抗体与预活化的Sepharose4B偶联制成免疫亲和层析柱,采用自制的免疫亲和层析柱纯化由摇瓶发酵获得的抗Pgp/抗CD3双功能抗体,采用间接免疫荧光法测定抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合活性。结果：成功地制备了可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱,采用此柱纯化的抗体与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合的活性与带有E-tag纯化标志的抗体基本一致。结论：此介质可以替代价格高昂的E-tag亲和层析介质在纯化Pgp/抗CD3双特异双功能抗体中的应用,同时还可以避免由于E-tag纯化标志而带来的免疫原性问题,此项研究工作为抗Pgp/抗CD3双功能抗体将来在临床应用奠定了基础。     

嵌合抗CD20Fab诱导Daudi细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,本研究采用竞争性免疫荧光抑制实验,证实抗CD20 Fab片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20的结合。MTT法测定嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞的生长具有抑制作用,抑制作用呈剂量依赖性,其IC50为69μg/ml;利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20 Fab诱导细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20 Fab可诱导 Daudi细胞凋亡,其凋亡率是Rituxan的2倍。这些实验结果证实嵌合抗CD20 Fab通过诱导Daudi细胞凋亡的机制抑制Daudi细胞生长。     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体并研究其生物活性.方法：分离纯化后的抗CD3 ScFv蛋白免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体;采用ELISA和Western blot鉴定其亚类和抗原结合特异性;采用FACS测定抗抗CD3 ScFv单克隆抗体对Jurkat细胞特异活性.结果：成功筛选出一株能稳定分泌抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的杂交瘤细胞株（10B7）,其分泌的抗体亚类为IgG1.该抗抗CD3 ScFv单克隆抗体直标后可特异性结合抗CD3 ScFv蛋白和抗CD3抗体.结论：文中所研制的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体具有与抗CD3抗体、抗CD3 ScFv蛋白特异结合的活性,在肿瘤导向治疗中抗CD3/抗肿瘤双特异抗体的亲和层析纯化、药代动力学监测等方面具有广泛的应用前景.     

抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD28VH单链三特异抗体的胞内可溶表达、纯化及体外活性测定

目的　研究抗人卵巢癌 (ovariancarcinoma ,oc)×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体(singlechaintrispecificantibody,scTsAb)在大肠杆菌中的可溶表达与纯化及纯化后产物的活性测定 ,从而为其应用于卵巢癌治疗的临床研究打下基础。方法　将已构建的scTsAb表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)Star菌株 ,采用低温 (30℃ )、低剂量IPTG(0 .2mmol L)诱导 ,进行胞内可溶表达。根据抗卵巢癌三特异抗体 (ocTsAb)等电点较高 (pI9.0 ) ,而菌体蛋白大多为酸性蛋白的特点 ,利用DEAE弱阴离子交换层析(pH8.0 )进行一步纯化 ,并利用ELISA及FACS的方法检测纯化后抗卵巢癌三特异抗体的活性。结果　(1)SDS PAGE鉴定低温诱导时可溶比例达到 5 6 %。 (2 )绝大多数菌体蛋白被DEAE层析柱吸附 ,而抗卵巢癌三特异抗体在穿透液中流出 ,SDS PAGE检测纯度达到 90 %。 (3)ELISA结果显示纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与重组CD2 8纯抗原 ,Jurkat(CD3 )细胞膜提取抗原 ,SKOV3细胞膜提取抗原均有特异性结合。 (4 )FACS结果证明纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与Jurkat(CD3 )活细胞、SKOV3活细胞有特异性结合。结论　低温诱导胞内可溶表达的抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体经弱阴离子交换层析一步纯化后仍保持原有免疫学活性 ,这     

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异单链抗体介导的效应细胞在体外对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的　研究双特异单链抗体 (scBsAb)介导的Jurkat细胞 (CD3+ )及人外周血单个核细胞(PBMC)在体外对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的杀伤活性 ,从而探讨其用于卵巢癌治疗的可能性。方法以抗人卵巢癌×抗人CD3scBsAb激活效应细胞 ,以SKOV3为靶细胞 ,用MTT法测定不同实验条件下的杀伤活性。结果　 (1)以重组白细胞介素 2 (rIL 2 )、抗CD3单克隆抗体、抗CD2 8重链单域抗体 (VH)预刺激Jurkat及PBMC细胞比单纯用scBsAb激活效应细胞杀伤活性高 ;(2 )以Jurkat细胞或PBMC细胞作为杀伤细胞可得到相似的杀伤活性 ,最高杀伤率均在 75 %左右 ;(3)杀伤活性与scBsAb的浓度、作用时间及效靶比有关。对于Jurkat细胞 ,在抗体终浓度为 2 1μg ml,反应时间为 4 8h ,效靶比为 10∶1时达到最大杀伤率 74 .8% ;对于PBMC细胞 ,在抗体浓度为 2 0 μg ml,反应时间为 72h ,效靶比为 1∶1时达到最大杀伤率73.1%。 (4 )多因子联合应用能有效提高杀伤活性。结论　scBsAb在体外能够有效介导效应细胞杀伤肿瘤细胞 ,有明显的抗癌作用 ,具有潜在的应用前景。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。     

抗人CD38单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的：研制抗人CD38抗原分子的单克隆抗体，进一步研究其生物学功能。方法：采用高表达CD38抗原的Daudi细胞免疫Balb/c小鼠；取其脾细胞与SP2/0细胞融合；用间接免疫荧光法进行杂交瘤筛选；流式细胞术、免疫沉淀法与CD38分子原核表达产物的Western-blot分析鉴定单克隆抗体的特异性。以MTT（四甲偶氨唑盐）法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。结果：获得了一株抗人CD38分子的单克隆抗体1C6，流式细胞术显示它具有CD38抗原特异的细胞反应谱，其识别的抗原分子质量为45000u。与CD38分子原核表达产物的Western-blot分析表明，其可特异识别CD38分子胞外结构域。MTT法显示其可介导补体杀伤靶细胞。结论：成功制备了抗人CD38分子的单克隆抗体，并进行了初步的功能研究。     

微型双功能抗体在裸鼠体内介导人T细胞杀伤白血病细胞

目的:研究抗CD3/抗CD19微型双功能抗体介导人T细胞对白血病细胞的特异性靶向杀伤活性。方法:利用Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞,FACS检测T细胞表面标记CD25和CD69激活后的表达变化,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)的释放,建立BALB/c裸鼠Raji细胞移植瘤模型,测定该双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性。结果:激活的T细胞,双功能抗体组CD25和CD69的表达以及释放Perforin和Granzyme A的量均明显高于对照组,在对人白血病裸鼠移植瘤模型的生物治疗中,抗CD3/抗CD19微型双功能抗体能有效抑制白血病移植瘤的生长。结论:抗CD3/抗CD19微型双功能抗体在体外及动物肿瘤模型实验中能介导人T细胞有效杀伤白血病细胞,具有潜在的临床应用前景。     

去除Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体原核表达载体的构建及表达

目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定。通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:无Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体经测序证实其序列正确。SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25000和26000,与预期Mr相符。去除Etag的Dia-body[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%。竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%。结论:成功构建了不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化。不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和Pgp靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低。     

CD20scFv-IgGFc T 淋巴细胞的建立及其对B细胞淋巴瘤靶向杀伤作用的比较

目的：研究CD20scFv嵌合T淋巴细胞靶向杀伤Daudi细胞时杀伤的效果和T细胞活化情况。方法：将两种质粒转染至PA317细胞中，用转染成功的PA317上清液感染外周血T淋巴细胞后经800 mg/L的G418筛选1周后去杀伤Daudi、K562细胞，分别在不同时点用流式细胞仪检测Daudi细胞AnnexinⅤ的阳性率 ，用ELISA检测细胞因子IL-2、IFNγ。结果：Daudi细胞AnnexinⅤ的阳性率在24 h内两实验组与K562组相比明显增高，而实验组之间没有显著差异。72 h时CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ组比CD20scFv-IgGFc组IL-2（1 509.00 ng/L比220.54 ng/L）和IFNγ（912.16 ng/L比251.42 ng/L）的分泌量有显著增高。结论：①两种CD20scFv特异的T细胞在引起Daudi细胞早期凋亡无显著差异，说明在CD20scFv的靶向杀伤过程中CD28-ζ基因可能不主导Daudi细胞的早期凋亡。②CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ组IL-2、IFNγ增幅更加明显，说明CD3ζ和CD28嵌合的T细胞可以自身活化而不受MHC的限制，从而增强了T细胞的活化和杀伤等功能。     

两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及生物学特性的研究

目的 :研制功能性抗CD4 0L单克隆抗体 ,探讨其生物学特性及其运用价值。方法 :采用B淋巴细胞融合、免疫荧光、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD4 0LmAb ,通过Daudi细胞生长抑制试验、混合淋巴细胞反应观察抗CD4 0LmAb的生物学功能。结果 :经表型分析、Westernblot和竞争抑制试验 ,证实mAbB1、mAb4F1是识别人CD4 0L分子的特异性单抗 ,且识别的位点不同 ;mAbB1、mAb4F1均能不同程度地拮抗CD4 0L TC介导的Daudi细胞生长抑制和抑制混合淋巴细胞反应。结论 :成功地获得两株能稳定分泌特异性抗人CD4 0L单克隆抗体的杂交瘤 (1B1、4F1) ,这两株单抗对CD4 0L的生物学功能具有明显的阻断作用 ,为阻断型单抗     

利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。     

小鼠CTL体外非特异性扩增对其杀瘤活性的影响

目的 在体外用抗CD3单抗、抗CD28单抗和白细胞介素2（IL－2）扩增肿瘤特异性CTL,为肿瘤过继治疗提供足够数量的、具有高度杀瘤活性的效应细胞。方法 采用两种方案培养肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞。（1）抗CD3单抗刺激48h后,加入抗CD3单抗和20U／mlrIL－2（抗－CD3＋IL－2组）;（2）抗CD3单抗和抗CD28单抗同时刺激48h后,加入抗CD3单抗、抗CD28单抗和20U／ml rIL－2（抗－CD3＋抗－CD2＋IL－2组）。分别检测2组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型。结果 抗CD3＋IL－2组细胞的^3H－TdR掺入量在第6天、12天、20天分别为22126、52426、2072,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组细胞的^3H-TdR掺入量在第6天、12天、30天分别为32168、12922、3265,后者明显高于前者。在培养12d时,抗－CD3＋IL－2组细胞对FBL03的最大杀伤活性为66．4％,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组细胞对FBL－3的最大杀伤活性为77．8％。细胞表型FACS分析结果表明,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组培养12d后的细胞90％以上为Thy1.2^ 细胞,且CD25^ 细胞在抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组、抗－CD3＋IL－2组分别为23．00％、8．15％。结论 抗CD3单抗、抗CD28单抗和低剂量IL－2同时非特异性刺激,可获得大量扩增的、具有高度杀瘤活性的肿瘤特异性CTL。     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。