肺鳞癌患者线粒体DNA编码区序列突变研究

背景与目的 吸烟是肺癌发病的重要因素,但吸烟在肺癌发生发展中的机制目前尚不清楚.本研究旨在分析肺鳞癌患者外周血白细胞、癌旁组织及癌组织线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)编码区序列的突变情况,并探讨其临床意义.方法 应用改良一步法制备15例肺鳞癌患者外周血白细胞、癌旁组织及癌组织mtDNA,PCR产物直接测序,对比分析编码区序列突变情况.结果 15例肺鳞癌患者癌组织mtDNA编码区中,有11例(73.33%)发生突变,共发现18个突变,其中10例患者有长期吸烟病史.结论 肺鳞癌患者mtDNA编码区突变可能与吸烟密切相关.     

肺癌患者全线粒体DNA体细胞性突变检测

目的　检测肺癌患者线粒体DNA体细胞性突变并探讨它在肿瘤发生中的作用。方法　利用时相温度梯度凝胶电泳对 16例肺癌患者的肿瘤及相应癌旁组织全线粒体DNA进行突变筛查 ,然后直接测序明确突变并进行分析。结果　在 10例 ( 62 .5 % )患者中发现 2 9个体细胞性突变 ,其中 2个位于rRNA区( 6.90 % ) ,10个位于mRNA区 ( 3 4.48% ) ,17个位于高变D环区 ( 5 8.62 % )。检测到 2例肿瘤和 3例癌旁组织具有常见的 4977bp缺失突变。除np3 0 3～ 3 0 9位点具有长度不稳定外 ,未发现其它微卫星区域不稳定。结论　肺癌患者的线粒体DNA存在高频率的体细胞性突变。     

简便快速提取人肺癌组织线粒体DNA

背景与目的线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)突变与肿瘤的关系是目前研究的热点,而mtDNA的提取方法是这些研究的重要步骤。但现有的mtDNA提取方法较繁琐复杂,本研究拟建立一种简便快速提取人肺癌组织线粒体DNA的方法,为进一步探讨mtDNA突变与肺癌的发生发展的关系作准备。方法应用碱裂解法和氯仿异戊醇直接提取40例肺癌手术切除组织标本中mtDNA,然后用PCR扩增产物来鉴定所提取的mtDNA。结果获得的mtDNA样品不存在蛋白质等污染,用特异性mtDNAPCR引物,从40份样品中均能扩增出1528bpmtDNA基因片段。每克癌组织可获(7.97±0.12)μgmtDNA。结论该方法是快速、实用、重复性好的组织细胞mtDNA提取方法,适用于临床及科研中标本量少及大批量提取mtDNA。     

Restriction enzyme analysis of human leukemic mitochondrial DNA

Mitochondrial DNA from both normal human tissue and leukemic human leukocytes (AML and CML) were analyzed by restriction-enzyme digestion, polyacrylamide gradient gel electrophoresis and ethidium bromide staining. Both normal and leukemic human mitochondrial DNA show molecular heterogeneity from individual to individual. This intraspecies variability is significantly higher in leukemias, where most of the cases show unique patterns. We suggest that this variability might be a molecular symptom of mutagenesis.     

西妥昔单抗对肺腺癌ＳＰＣ-Ａ-１细胞放射增敏作用研究

目的　探讨西妥昔单抗（Ｃ２２５）联合放射治疗对肺腺癌ＳＰＣ-Ａ-１细胞的放射增敏作用。方法　成克隆细胞形成实验分为对照组（６ＭＶ-Ｘ线照射）和实验组（６ＭＶ-Ｘ线照射＋Ｃ２２５）,分别给予０、１、２、４、６、８Ｇｙ照射后培养１０天,计数≥５０个细胞的克隆数。采用多靶单击模型进行数据处理,拟合细胞存活曲线,计算细胞增敏比（ＳＥＲ）。用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色观察细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果　成克隆细胞形成实验结果显示,扣除Ｃ２２５毒性影响后实验组的存活分数比对照组低（Ｐ＜０.０５）,ＳＥＲＤ０为１.４２。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色荧光显微镜下观察,实验组细胞核呈波纹状,染色质浓缩。细胞凋亡实验结果显示,对照组和实验组０、２、４、８Ｇｙ的凋亡率分别为（４.４５±０.４５）％、（１１.０９±１.０３）％、（２０.３０±０.７０）％、（２３.９１±０.３７）％和（１１.００±１.４２）％、（２０.１０±１.５８）％、（３６.９０±１.８８）％、（４０.４１±１.１５）％（Ｐ＜０.０５）。结论　Ｃ２２５对ＳＰＣ-Ａ-１细胞系有放射增敏作用,其机制可能与诱发细胞凋亡有关,该结果为临床综合治疗肺癌提供了理论基础。     

放射性核素骨显像在建立人肺腺癌骨转移细胞株中的应用

目的:探讨采用放射性核素骨显像技术建立人肺腺癌骨转移细胞株SIC-A-1BM以及在免疫缺陷BNX小鼠的转移动物模型活体成像中的作用.方法:将人肺腺癌细胞株SIC-A-1注射入小鼠左心室,形成骨转移,在放射性核素骨显像剂示踪下寻找到骨转移灶,然后切除病变组织进行体外培养以获得转移性肺腺癌细胞.利用获得的第1代肺腺癌骨转移细胞,经血液(动、静脉系统)和肺原位途径进行种植,按上述步骤重复多个循环.结果:染色体分析结果确定亲代SPC-A-1细胞经小鼠体内-体外连续筛选,通过放射性核素骨显像后显示,获得的肺腺癌骨转移细胞株(SIC-A-1BM)未改变人源细胞属性.99mTcMDP和X射线的放射剂量对SPC-A-1BM细胞生长影响的结果表明,111 MBq的99mTc-MDP对人肺腺癌骨转移细胞生长的影响类似于且略小于40 kV、2 mA、4 s的X射线.放射性核素骨显像与X线摄片检测出的小鼠骨转移的敏感度、特异度和准确度分别为97.6%和31.3%、73.3%和100%以及94%和43%.结论:放射性核素骨显像技术为建立人肺腺癌骨转移细胞株SIC-A-1BM及其免疫缺陷BNX小鼠转移动物模型活体成像提供了一种实用且便捷的实验手段.     

肺癌细胞系线粒体DNA非编码区序列变异研究

背景与目的 线粒体DNA（mtDNA）非编码区在mtDNA转录过程中起重要的调控作用，mtDNA非编码区的突变将直接影响其转录和翻译，从而改变细胞的能量代谢。本研究的目的是分析7种肺癌细胞系mtDNA非编码区序列的变异情况并探讨其意义，为肺癌细胞系mtDNA变异研究提供基础信息。方法 培养7种常用肺癌细胞系，包括人肺腺癌A549、SPC-A-1、Calu-3、LTEP-a-2，人肺扁平上皮癌QG-56，人高转移肺癌95-D以及人小细胞肺癌NCI-H446，应用改良一步法提取7种肺癌细胞系mtDNA，以剑桥mtDNA序列为标准，分析非编码区序列变异情况。结果 7种肺癌细胞系mtDNA非编码区存在不同程度的碱基变异，其中LTEP-a-2细胞系变异率最高，为1．82％，A549细胞系最低，为0．21％。结论 率先成功完成了7种人肺癌细胞系mtDNA整个非编码区的测序，揭示了这7种肺癌细胞系mtDNA非编码区碱基变异背景，为后续实验研究提供了理论基础和参考依据。     

高转移性人肺腺癌细胞株SPC-A-1BM的建立及其特性分析

目的:建立高转移性人肺腺癌细胞株SPC-A-1BM及其免疫缺陷小鼠转移动物模型。方法:将人肺腺癌细胞株SPC-A-1经免疫缺陷小鼠血道或肺原位接种后形成转移,在放射性核素示踪下找到骨转移病灶,然后切除病变骨组织进行体外培养获得转移性肺癌细胞,用这些癌细胞重复以上循环10次,获得高转移肺癌细胞。采用荧光定量PCR方法检测亲代细胞和高转移细胞的基因表达。结果:获得以骨转移为主,肺、肾上腺、淋巴结等多脏器转移的人肺腺癌转移细胞株(SPC-A-1BM)及其免疫缺陷小鼠动物模型。定量PCR检测显示SPC-A-1BM的上皮生长因子受体(EGFR/HER)家族、血管内皮生长因子(VEGF)家族和3个抗凋亡蛋白的基因较原代细胞均有不同程度的变化。结论:SPC-A-1BM是以骨转移为主的高转移性人肺腺癌细胞株,该细胞株及其转移动物模型为肺癌转移的生物学研究提供了一个良好的技术平台。     

Mutations in the mitochondrial DNA D-Loop region occur frequently in human osteosarcoma

To explore the polymorphisms and mutations of mitochondrial D-Loop region in osteosarcoma and their possible association with carcinogenesis, direct DNA sequencing method was used to detect the variants of the mitochondrial D-Loop in 20 patients with osteosarcoma. We found mutations of the mitochondrial D-Loop in 14/20 (70%) of the tested osteosarcoma samples, including 34 novel mutations. We did not detect any new polymorphisms in osteosarcomas, nor was there any association between variants and the three histopathological subtypes. We identified 89 variant sites, most of which were within the hypervariable I and II (HV I and HV II) regions. These data suggest that mtDNA mutations within the D-Loop region, particularly the HV I and HV II segments, are a frequent event in osteosarcomas.     

Association between Restriction Fragment Length Polymorphism of the Human Cytochrome P450IIE1 Gene and Susceptibility to Lung Cancer

Cytochrome P450IIE1 (P450IIE1) is involved in metabolic activation of carcinogenic nitrosamines, aniline and benzene. We detected a restriction fragment length polymorphism of the human P450IIE1 gene with the restriction endonuclease Oral. The population was thus divided into three genotypes, namely, heterozygotes (CD) and two forms of homozygotes (CC and DD). The distribution of these genotypes among lung cancer patients differed front that among controls with statistical significance of P< 0.05 (x²=7.01 with 2 degrees of freedom). This result strongly suggests that host susceptibility to lung cancer is associated with the Dral polymorphism of the P450IIE1 gene.     

Frequent Loss of Heterozygosity on Chromosomes 16 and 4 in Human Hepatocellular Carcinoma

By restriction fragment length polymorphism analysis, we examined loss of heterozygosity at 34 loci on 23 chromosomes in 35 surgically resected human hepatocellular carcinomas. Allele losses at the HP locus on chromosome 16q22 and at the MT2P1 locus on chromosome 4p11-q21 were detected in 57% (8/14) and 50% (8/16) of cases, respectively. Loss of heterozygosity on chromosomes 16q and 4 occurred simultaneously in 4 of 7 informative cases for both loci, and seemed to be important in the development of human hepatocellular carcinoma irrespective of the presence of hepatitis B virus infection. In contrast, the incidence of allele loss was low at the other loci, e.g., chromosome 1p, 3p, 11p, 13q or 17p, where one allele is frequently lost in other cancers.     

喉鳞状细胞癌组织中线粒体基因4977bp缺失突变的检测

背景与目的:线粒体DNA4977bp缺失突变是机体衰老的分子生物学标志之一,已证实其存在于多种实体性肿瘤中,该突变与喉鳞状细胞癌之间的关系尚不明确。本文旨在探讨喉鳞状细胞癌组织中线粒体基因4977bp缺失突变的发生情况及其与喉癌组织分化水平之间的关系。方法:取喉癌组织35例,均经病理证实为喉鳞状细胞癌。提取肿瘤组织总DNA,利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)对线粒体基因4977bp缺失进行检测。PCR产物直接测序。结果:35例标本中有20例(57.14%)检测到线粒体基因4977bp缺失突变,其中7例高分化喉鳞癌中有5例,24例中分化喉鳞癌中有15例,4例低分化喉鳞癌未检测到该缺失突变。经统计学分析,高分化、中分化级别喉鳞癌组织4977bp缺失突变发生率与低分化相比有显著性差异(P<0.05),而高分化和中分化之间无显著性差异(P>0.05)。结论:喉鳞状细胞癌组织中存在线粒体DNA4977bp缺失突变,该突变的发生可能与肿瘤组织分化水平有关。     

稳定过表达人MGST1基因抑制肺腺癌细胞SPC A 1的凋亡

目的:建立稳定过表达微粒体谷胱甘肽S转移酶1(microsomal glutathione S-transferase 1,MGST1)基因的市腺癌SPC-A-1细胞系,探讨MGST1在肺腺癌中的作用及其机制.方法:重组质粒pcDNA3-MGST1和空载体pcDNA3以脂质体介导的方法转染至SPC-A-1细胞中,经过G418筛选稳转细胞系,标记为pcDNA3-MGST1细胞和空载体pcDNA3细胞.实时荧光定量PCR及Western blotting鉴定稳转细胞中MGST1 mRNA和蛋白的表达情况.MTS法检测稳转细胞的活力;流式细胞仪和Western blotting检测H2O2诱导下稳转细胞的凋亡率和下游凋亡相关蛋白水平变化.结果:酶切鉴定和测序结果显示pcD-NA3-MGST1重组质粒构建成功,并获得具有G418抗性的稳转细胞株.pcDNA3-MGST1细胞中MGST1在mRNA和蛋白水平表达均显著升高(P＜0.01),且细胞活力明显增加(P＜0.05).H2O2诱导下,pcDNA3-MGST1细胞的早期凋亡率明显低于pcDNA3组[(3.30±0.40)％vs(6.50±0.95)％,P＜0.05];pcDNA3-MGST1细胞凋亡相关蛋白caspase 9、caspase 3、PARP表达增多,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP表达明显减少.结论:本研究成功构建了稳定过表达MGST1的SPC-A-1肺腺癌细胞系,MGST1可能通过调节caspase凋亡通路抑制肺腺癌细胞的凋亡.     

癌细胞mtDNA限制性片段长度多态性分析

目的探讨人癌细胞ｍｔＤＮＡ与正常细胞ｍｔＤＮＡ一级结构的差异。方法采用一步法制备包括肺腺癌ＳＰＣ－Ａ－Ａ、ＰＬＡ－８０１Ｄ、Ａ５４９、Ａ５３１,肝细胞癌ＳＭＭＣ－７７２１,膀胱上皮癌ＥＪ共６个癌细胞系ｍｔＤＮＡ;用ＰｖｕⅡ、ＸｈｏⅠ、ＰｓｔⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＢｓｔＥⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＨｐａⅠ、Ｂｃ１Ⅰ、ＥｃｏＲⅤ、ＳｃａⅠ和ＸｂａⅠ共１１种限制性内切酶对所得ｍｔＤＮＡ进行ＲＦＬＰ分析;并用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法分析了癌细胞ｍｔＤＮＡ非编码区结构变化。结果６个癌细胞系其ｍｔＤＮＡ基因编码区的３２个酶切位点均无变异,而有３个癌细胞系在其ｍｔＤＮＡ非编码区第１６２７６位核苷酸处出现了ＥｃｏＲⅤ新的酶切位点。结论提示癌细胞ｍｔＤＮＡ基因编码区一级结构相当稳定,而主要的核苷酸变异可能位于其ｍｔＤＮＡ非编码区。     

水通道蛋白在人肺腺癌细胞株中的表达和意义

目的　探讨水通道蛋白在人肺腺癌细胞株SPC A 1中的表达及其意义。方法　利用半定量逆转录PCR和免疫组织化学染色分析水通道蛋白 1、3、4、5在SPC A 1细胞中的表达。结果　免疫组化染色显示水通道蛋白 3和水通道蛋白 5在SPC A 1细胞膜上呈阳性染色 ,而水通道蛋白 1和水通道蛋白 4未见阳性染色。半定量逆转录PCR结果显示SPC A 1细胞水通道蛋白 3和水通道蛋白 5mRNA表达阳性 ,后者表达水平显著高于前者 (P <0 .0 1) ;水通道蛋白 1和水通道蛋白 4mRNA未见表达。结论　人肺腺癌细胞株SPC A 1中有水通道蛋白 3和水通道蛋白 5表达 ,二者在肺腺癌细胞株水转运中的作用有待进一步探讨     

双氢青蒿素抗人肺腺癌A549细胞生长的实验研究

背景与目的　研究发现,青蒿素类药物具有抗肿瘤活性。双氢青蒿素是青蒿素类药物中活性较强的衍生物。本研究的目的是观察双氢青蒿素对肺腺癌A549细胞生长的影响,以便为肺癌治疗提供实验依据。方法　双氢青蒿素对体外培养肺腺癌A549 细胞的生长抑制作用采用MTT检测法,用细胞计数法绘制细胞生长曲线,计算对数生长期群体倍增时间,用流式细胞术检测细胞DNA含量,同时分析药物对细胞周期的影响。体内实验采用裸鼠移植瘤模型进行实验。结果　双氢青蒿素有较强的抑瘤效应,半数抑瘤浓度为0.23μmol/l。人肺腺癌A549细胞对数生长期群体倍增时间在对照组为21. 3 h,在双氢青蒿素作用组为38.5 h,两组比较有显著性差异(P<0.01)。流式细胞仪显示双氢青蒿素作用后G0 +G1 期细胞数增加。移植瘤体内试验显示双氢青蒿素的抑瘤率为54.3%。结论　双氢青蒿素对人肺腺癌A549 细胞在体内外均有生长抑制作用,体外作用与G0+G1 期阻滞有关。     

半人工合成手性多西紫杉醇对肺腺癌细胞株A549的细胞毒性及放射增敏作用

目的:探讨半人工合成手性多西紫杉醇对人肺癌细胞株A549的细胞毒性及放射增敏作用。方法:半人工合成手性多西紫杉醇,测定其对A549细胞的生长抑制作用,观察其对A549细胞的形态学影响及其放射增敏作用和对动物荷瘤模型的作用。结果:不同浓度半人工合成紫杉醇对A549细胞均有抑制作用,可引起A549细胞G2/M期阻滞,抑制荷瘤小鼠模型肿瘤的生长,其中空白对照组、单纯药物组、单纯放射组和联合处理组的肿瘤体积分别为(7780±1050)mm3、(4610±950)mm3、(5540±1035)mm3和(560±112.5)mm3,各组间有明显差异。结论:半人工合成紫杉醇对A549细胞株具有明显的抑制作用,且与射线照射有协同作用。     

半人工合成手性多西紫杉醇对肺腺癌细胞株A549的细胞毒性及放射增敏作用

目的：探讨半人工合成手性多西紫杉醇对人肺癌细胞株A549的细胞毒性及放射增敏作用。方法：半人工合成手性多西紫杉醇，测定其对A549细胞的生长抑制作用，观察其对A549细胞的形态学影响及其放射增敏作用和对动物荷瘤模型的作用。结果：不同浓度半人工合成紫杉醇对A549细胞均有抑制作用，可引起A549细胞G2／M期阻滞，抑制荷瘤小鼠模型肿瘤的生长，其中空白对照组、单纯药物组、单纯放射组和联合处理组的肿瘤体积分别为（7780±1050）mm^3、（4610±950）mm^3、（5540±1035）mm^3和（560±112．5）mm^3。各组间有明显差异。结论：半人工合成紫杉醇对A549细胞株具有明显的抑制作用，且与射线照射有协同作用。     

Detailed deletion mapping of the short arm of chromosome 3 in small cell and non-small cell carcinoma of the lung

We constructed a detailed deletion map of the short arm of chromosome 3 (3p) for 55 lung cancer cases by using 17 restriction fragment length polymorphism (RFLP) probes. Initially, we examined 40 small cell lung cancer (SCLC) cases and found three regions of deletion at 3p25–26, 3p21.3 and 3p14-cen. suggesting the possibility of at least three different tumor-suppressor genes on 3p. In order to obtain more detailed deletion area, and to compare the pattern of 3p deletion, we also examined 15 non-small cell lung cancer (NSCLC) cases. Compared to NSCLC cases, most of SCLC cases have widespread deletion on 3p, suggesting multiple tumor-suppressor genes on 3p may be inactivated in this type of cancer. In 3p21.3 area, minimum overlapping area of deletion lays between two probes which are close to each other. These data will be useful to isolate the putative tumor-suppressor genes located on the chromosome 3p.     

应用基因芯片技术筛选人肺腺癌SPC-A1多西他赛耐药差异表达基因

背景与目的多西他赛是近年来应用于临床的一种有效的化疗药物,其独特的作用机制使其具有良好的应用前景,然而耐药性影响其更广泛的应用。本研究的目的是应用基因芯片比较人肺腺癌多西他赛耐药细胞系SPC-A1/Docetaxel与其亲本株基因表达的差异,筛选与耐药相关的基因。方法分别提取SPC-A1/Docetaxel与其亲本株SPC-A1的总RNA并纯化mRNA,将等量 mRNA逆转录合成cDNA,在Affy-metrix HG-U133A2.0基因芯片上杂交,扫描荧光信号图像,用Affymetrix Gene Chip Operating Software Ver-sion1.0软件进行数字化处理和分析,进一步采用RT-PCR验证部分差异表达基因。结果SPC-A1/Do-cetaxel与SPC-A1差异表达基因一共有934条,其中上调428条,下调506条。差异表达的基因涉及ABC运载体、凋亡、微管蛋白、信号传导、酶等多方面。RT-RCR验证显示,SPC-A1/Docetaxel细胞ABCB1、ABCC4、ABCG2、BCL-2、TUBB2A、TUBB2C、TUBB3的表达明显高于SPC-A1,而SPC-A1/Docetaxel细胞BAX的表达明显低于SPC-A1。结论这些差异表达的基因可能与人肺腺癌细胞的多西他赛耐药性相关。