HBV感染者胎盘组织HBV ccc DNA检测

目的建立HBV ccc DNA在胎盘组织中定性及定位检测方法,了解慢性HBV感染者胎盘组织中HBV ccc DNA的存在状况,进一步探讨其意义及乙型肝炎病毒母婴传播机制。方法选取首都医科大学北京地坛医院慢性乙型肝炎病毒感染者孕晚期胎盘组织40例,阳性对照肝组织标本3例,阴性对照为健康足月妊娠产妇胎盘标本,共5例。所有胎盘标本均分两份,分别于-80℃冷冻和福尔马林室温浸泡保存。冷冻标本采用质粒抽提法提取胎盘组织中HBV ccc DNA,液相PCR定性检测;福尔马林处理标本作石蜡切片,用于原位PCR定位检测。结果 40例标本中,液相PCR检测出HBV ccc DNA阳性者8例,其相应的血清HBV DNA均>105拷贝/ml。取该8例及另2例乙型肝炎患者孕晚期胎盘石蜡切片经HBV ccc DNA原位扩增,7例检测出HBV ccc DNA阳性,胎盘绒毛毛细血管内皮细胞、绒毛合体滋养层细胞、PBMC等多种细胞均存在HBV ccc DNA阳性信号。结论研究表明,胎盘组织HBV感染与孕妇血液中HBV DNA含量显著相关。胎盘组织的HBV ccc DNA原位PCR检测显示,HBV可感染胎盘各层细胞。羊膜上皮细胞中也发现HBV ccc DNA阳性信号。胎盘组织感染的HBV及其在这些细胞中的复制是否直接与HBV宫内感染相关尚需进一步研究。     

长春地区孕妇感染弓形虫株的基因分型北大核心CSCD

目的鉴定长春地区孕妇感染弓形虫株的基因型。方法采用间接ELISA法检测长春地区840名孕妇血清中抗弓形虫IgG抗体,阳性者提取全血DNA,以弓形虫529bp高度重复序列为靶基因进行PCR扩增,用多基因位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析鉴定PCR阳性标本的基因型。结果 ELISA检测80份标本IgG阳性,其中33份标本同时PCR阳性。对PCR阳性标本进行PCR-RFLP分型鉴定,有8份标本为基因Ⅱ型。结论长春地区孕妇感染的弓形虫主要为基因Ⅱ型。     

RNA原位杂交法检测组织内弓形虫的实验研究

目的　探讨RNA原位杂交法在弓形虫病理检测中的应用。方法　设计并合成弓形虫SAG2基因来源的寡核苷酸探针。弓形虫RH株感染昆明株小鼠 ,分别于感染后第 2、3、4、5、6、7天处死 ,取肝组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交 ,结果同HE染色及免疫组化相比较。结果　RNA原位杂交法于感染后第 2天检到阳性结果 ,组织内弓形虫的检出率 (2 8/ 2 8)高于免疫组化 (2 1/ 2 8)及HE染色法 (16 / 2 8)。结论　RNA原位杂交法是一种简便准确的弓形虫病理检测方法。     

应用免疫-PCR检测弓形虫循环抗原的实验研究

目的　控索弓形虫感染早期诊断方法。方法　用链亲素将生物素化的二抗和生物素化的 DNA偶联起来 ,通过PCR扩增标记 DNA检测固定的抗原 ,建立了弓形虫循环抗原免疫— PCR检测技术 ,用该技术和 EL ISA法平行检测系列稀释的弓形虫的感染鼠阳性血清中的 CAg以及实验感染鼠血清中 CAg的动态变化 ,对比研究二者之间的敏感性。结果　免疫—PCR法检测弓形虫 CAg吴阳性的血清最高稀释度为 1∶ 10 0 0 ,EL ISA法检测弓形虫 CAg呈阳性的血清最高稀释度为 1∶ 5 ,免疫— PCR最早在鼠感染弓形虫后第 3天测到 CAg,EL ISA最早在鼠感染弓形虫后第 5天测到 CAg。结论　免疫— PCR是一种特异性强、敏感性高的弓形虫 CAg检测方法 ,敏感性较 EL ISA法提高了 2 0 0倍 ,免疫— PCR检出阳性结果时间早 ,为弓形虫病早期诊断提供了科学依据     

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。     

弓形虫既往感染在孕期内对胎儿的影响

目的探讨既往感染者孕期内弓形虫的活动情况及对胎儿的影响。方法对68例抗弓形虫抗体IgG阳性、IgM阴性孕妇的血清、脐血采用酶联免疫吸附试验检测弓形虫抗体IgG、IgM、弓形虫循环抗原（CAg）,PCR法检测虫体DNA;胎盘样本采用直接涂片、匀浆涂片及PCR法观察弓形虫感染情况。结果68例弓形虫抗体IgG阳性孕妇中脐血弓形虫抗体IgG阳性28例,IgG胎盘垂直传播率41.2%;脐血弓形虫DNA阳性6例,宫内感染发生率8.8%;胎盘组织中虫体DNA阳性9例,宫内感染发生率13.2%。结论既往弓形虫感染孕期内仍可导致垂直传播。     

PCR-ELISA检测弓形虫实验研究

目的建立快速、敏感、特异、稳定的PCR—ELISA方法，并用其检测感染动物体内的弓形虫。方法将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交，再通过酶免显色反应测出OD值。以判断弓形虫感染情况。测定该方法的敏感性、特异性及稳定性。再分别以10^4、10^3弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠。取全血、肝组织用PCR—ELISA检测小鼠感染情况。结果本实验中，PCR-ELISA方法的检测闻值为20fg弓形虫DNA，其灵敏度是电泳法的10倍，并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。同一样本重复测试5次，结果经统计学检验，一致性良好（Alpha=0．72）。检测感染动物肝组织及全血标本，10^4、10^3组分别在感染后第二d、第三d即可测出阳性，两种标本的阳性检出效率无统计学差异（P〉0．05）。结论PCR—ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法，可试用于临床弓形虫病的诊断及流行病学调查。     

DNA聚合酶链反应检测石蜡包埋人脑组织中弓形虫的研究

孕妇感染弓形虫是胎儿先天性畸形的危险因素。本文运用DNA聚合酶链反应检测30例先天性畸形儿尸检石蜡包埋脑组织中弓形虫。结果表明,30例先天性畸形儿石蜡脑组织切片经体外扩增后出现阳性条带者13例,而对照组无1例阳性(P<0.05)。研究结果进一步支持弓形虫感染与胎儿先天性畸形有密切关系。     

石蜡切片中卵巢癌基因1第2外显子PCR-SSCP检测法建立

目的建立从石蜡切片中检测卵巢癌基因(OVCA)1第2外显子的聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)检测方法。方法从石蜡切片中提取基因组DNA;以基因组DNA为模板,PCR扩增OVCA1第2外显子;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物SSCP,银染显色。结果 PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳检测可见条带位置正确,条带单一。对PCR扩增片段进行SSCP检测,可见清晰条带。结论成功建立了可用于石蜡切片中OVCA1第2外显子的PCR-SSCP检测方法。     

PCR技术检测生殖道弓形虫感染的临床实验分析

目的　通过对人类生殖道弓形虫感染状况的检测 ,探讨弓形虫感染与不孕不育的关系 ,以及弓形虫感染生殖道的可能方式。方法　实验设置不孕不育组和正常生育组夫妇 ,用PCR方法检测生殖道分泌物中弓形虫DNA ,把检测结果输入计算机进行SPSS统计学处理 ,分析弓形虫感染的概率。结果　不孕不育组弓形虫感染率为 18 15 % ,而正常生育组为6 2 9% ,P <0 0 1,两组间感染率有显著差异。夫妻之间感染率无显著性差异。结论　弓形虫感染与不孕不育有一定关系 ,夫妻间性行为可能是弓形虫传播的一种途径。     

核酸原位杂交检测人淋巴结组织中的弓形虫

目的：探讨弓形虫感染的淋巴结组织中的病原体检测。方法：用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和基因工程技术制备弓形虫（ＲＨ株）特异ＤＮＡ克隆片段，以地高辛随机引物法标记克隆的弓形虫ＤＮＡ片段作为探针，与淋巴结组织切片中核酸原位杂交试验（ＩＳＨ）检测病理标本中的弓形虫ＤＮＡ。结果：３２例何杰金淋巴瘤（ＨＤ）和４１例非何杰金淋巴瘤（ＮＨＬ）病理标本中各有一例阳性，４７例慢性淋巴结炎（ＣＬ）病理标本中呈ＩＳＨ阳性者２例，总阳性率为３．３％（４／１２０）。研究证明，所制备的探针能检测１０ｐｇ的ＤＮＡ，且特异性强。结论：核酸原位杂交为弓形虫病的病理标本中病原体检测提供了可行的方法。     

大鼠脑微量元素变化与弓形虫感染关系的研究

目的　检测感染弓形虫对大鼠脑 5种微量元素 (Fe+ + 、Cu+ + 、Zn+ + 、Ca+ + 、Mg+ + )的影响。方法　 2 0只大鼠随机均分为正常组和感染组。每只大鼠经腹腔注入 2ml含 1 5× 10 6弓形虫速殖子的生理盐水悬液 ,6 4d后将 2组大鼠处死 ,取脑组织 ,用原子吸收分光光度仪测定其微量元素的变化。结果　与正常组相比较 ,感染组脑组织Fe+ + 、Cu+ + 、Mg+ + 含量明显减少 (P <0 0 1) ;Ca+ + 增加 (P <0 0 1) ;Zn+ + 无明显变化。结论　弓形虫感染能引起大鼠脑组织微量元素的改变。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。　方法　用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。　结果　从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。　结论　成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB／c小鼠免疫保护性的研究

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

肾组织石蜡切片免疫荧光染色的新方法

目的:探讨高温修复联合酶消化法在肾组织石蜡切片进行免疫荧光染色及其在病理诊断中应用的可行性。方法:选取南京军区南京总医院全军肾脏病研究所经肾活检明确诊断为肾小球疾病的患者:狼疮性肾炎、抗肾小球基膜肾炎、致密物沉积病、轻链沉积病(κ)及淀粉样变性(λ)各4例,感染后肾小球肾炎、膜性肾病及膜增生性肾小球肾炎各6例,IgA肾病12例。采用高温修复(EDTA8.0高压锅加热)联合酶消化(胃蛋白酶)法对肾组织石蜡切片分别进行免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、补体(C3、C1q)、轻链(κ、λ)染色,并将石蜡切片免疫荧光染色与冰冻切片进行比较。结果:石蜡切片经高温修复联合酶消化法进行免疫荧光染色,IgG、IgA、C1q阳性率、分布部位和强度与冰冻切片免疫荧光染色结果相一致。石蜡切片IgM和C3染色分布部位与冰冻切片无差别,阳性率和染色强度略低于冰冻切片,但不影响诊断。κ、λ轻链沉积的阳性率、分布部位和染色强度与冰冻切片一致,轻链沉积病和淀粉样变性患者石蜡切片染色部位显示得更加清晰。石蜡切片的诊断符合率达100%,且结构更清晰,免疫复合物沉积部位较冰冻切片容易判断。结论:石蜡切片高温修复联合胃蛋白酶消化法进行免疫荧光染色为肾活检冰冻组织无肾小球提供可靠的替代方法。     

弓形虫不同分离株ROP1和P30基因的体外扩增

通过体外扩增弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２、ＧＴ１４个分离株的编码棒状体蛋白（ＲＯＰ１）和主要表膜蛋白（Ｐ３０）抗原的基因片段,比较虫株间差异,为克隆及其ＤＮＡ免疫的研究做准备。特定引物的设计;弓形虫虫株的复苏、接种、收集、纯化;提取弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２及ＧＴ１分离株的基因组ＤＮＡ,并以此为模板进行ＰＣＲ扩增,扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳分析。结果从４个分离株基因组ＤＮＡ中均扩增出编码ＲＯＰ１、Ｐ３０抗原的基因片段,其大小ＲＯＰ１约７５６ｂｐ,Ｐ３０约１０２５ｂｐ,电泳条带未见虫株间的明显差别。研究表明,所扩增４个弓形虫分离株的ＲＯＰ１和Ｐ３０基因片段均与理论预测值相符,并具有高度保守性。     

弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断

首次建立弓形虫人株(ZS_2株)基因组文库,筛选出一个弓形虫特异DNA片段的克隆。对该克隆的DNA片段(1.1kb)进行了限制性内切酶图谱分析。应用Southern印迹法及斑点印迹法检测,结果示同位素~(32)P标记的该克隆DNA片段能与弓形虫DNA、人工感染弓形虫幼猪白细胞和胸腺DNA、弓形虫感染病人DNA杂交,但不与正常人、正常幼猪外周血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、肺孢子虫、pBR322的DNA杂交。斑点杂交检测低限为100个弓形虫或500pg弓形虫DNA。该探针已成功地应用于多种弓形虫感染病例的检测,为弓形虫病提供了一个特异、灵敏的DNA诊断方法。