地塞米松对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞酪氨酸转氨酶活性诱导能力丧失的机制研究

目的:通过测定人肝癌SMMC-7721细胞酪氨酸转氨酶(TAT)cDNA序列,并观察其糖皮质激素受体(GR)通路是否存在异常,以探讨地塞米松(Dex)丧失诱导SMMC-7721细咆TAT活性的机制.方法:RT-PCR扩增SMMC 7721细胞全长TAT cDNA并进行测序;采用实时定量PCR观察Dex对SMMC-7721细胞TAT mRNA表达的影响,并与HepG2细胞作对照;采用电穿孔法将GR特异性报告基因GRE-tk-LUC及GRE-MMTV CAT分别瞬时转入SMMC-7721细胞中,观察Dex对荧光素酶(LUC)和氯酶素乙酰转移酶(CAT)表达的影响,并与HepG2细胞作对照.结果:SMMC-7721细胞TAT cDNA中第576位碱基存在同义突变;Dex能够诱导SMMC-7721细胞中TAT mRNA的表达.最大诱导倍数为2.22.明显低干HepG2细胞(15.1倍,P<0.01);Dex诱导了SMMC-7721细胞LUC及CAT的表达,与HepG2细胞无显著差异.结论:Dex对SMMC-7721细胞TAT mRNA诱导水平降低,可能是TAT活性不增高的主要原因.     

一氧化氮诱导肝癌细胞凋亡过程bcl-2和bax mRNA表达水平的变化

目的 探讨在一氧化氮(NO)诱导肝癌细胞凋亡过程bcl-2和bax mRNA表达水平的动态变化。方法 用NO供体硝普钠(SNP)诱导SMMC-7721和HepG2肝癌细胞株凋亡，RT-PCR的方法检测bcl-2、ba xmRNA表达水平，并采用凝胶分析系统进行半定量分析。结果 1．0mmol/L可降低SMMC-7721和HepG2细胞bcL2、bax mRNA的表达水平，提高bax/bc1-2 mRNA的比值并呈时间依赖性。HepG2细胞bcl-2和bax mRNA降低的幅度较SMMC-7721细胞小(P＜0．05)，开始变化的时间也较SMMC-7721细胞迟。结论 NO诱导肝癌细胞株的凋亡，可能与其bcl-2、bax mRNA表达水平变化导致bax/bc1-2 mRNA比值上升有关。     

甘草黄酮诱导肝癌ＳＭＭＣ-７７２１细胞凋亡及其对相关蛋白ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的影响

目的:探讨甘草黄酮(GF9)对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用及其机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测GF9对人肝癌细胞SMMC-7721细胞生长的影响,Hoechst染色法和电镜观察GF9诱导细胞凋亡的形态变化,流式细胞仪检测GF9诱导的细胞凋亡率,并通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白survivin和pro-caspase-3表达水平的变化.结果:GF9可抑制SMMC-7721细胞增殖,并呈时间剂量效应;400 μmol/L GF9可诱导细胞凋亡,呈时间依赖性;随着GF9作用时间的延长,survivin和pro-caspase-3表达下调.结论:GF9能诱导SMMC-7721细胞凋亡,这可能与GF9能够引起抑制凋亡蛋白survivin的下调有关.     

丹皮酚诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制探讨

目的:探讨丹皮酚诱导人肝癌细胞株SMMC-7721的凋亡作用及其分子机制。方法:噻唑蓝(MTT)法检测丹皮酚的增殖抑制作用;Hoechst-33258染色法、DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡;逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)法检测抑癌基因PTEN、致癌基因Akt mRNA表达水平。结果:丹皮酚在3.13~200.00 mg.L-1剂量之间均能抑制SMMC-7721的增殖;丹皮酚处理SMMC-7721后,光镜下可见明显的凋亡细胞;Hoches-33258染色、DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征;RT-PCR检测示丹皮酚可使PTEN mRNA表达升高,Akt1、Akt2 mRNA表达下降。结论:丹皮酚能显著抑制SMMC-7721增殖,诱导细胞凋亡,其作用可能是通过抑制PI3K通路来实现的。     

靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的 采用RNA干扰技术阻断STAT5基因的表达,观察其对人肝癌SMMC-7721凋亡的影响.方法 构建3种靶向STAT5的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,采用LipofectamineTM2000转染肝癌细胞SMMC-7721;分别采用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染前后SMMC-7721细胞STAT5 mRNA和蛋白质表达的变化;采用透射电镜技术观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 3条靶向STATS的序列特异性的siRNA可以有效地抑制SMMC-7721细胞STATS mRNA和蛋白质表达,STAT5 mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,STAT5蛋白表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%;转染靶向STAT5的siRNA真核表达载体48 h后出现凋亡细胞的典型形态学变化,并诱导25.61%的SMMC-7721细胞发生凋亡.结论 靶向STAT5的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断SMMC-7721细胞STAT5基因的表达,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,STAT5 siRNA在人肝癌的基因治疗中可能具有潜在的应用价值.     

5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素诱导人肝癌细胞生长抑制和凋亡

目的:研究5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR)对人肝癌(SMMC-7721)细胞生长和凋亡的影响.方法:平皿克隆形成法测定细胞锚定依赖性生长能力;吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色荧光显微镜观察凋细胞亡形态,计数细胞凋亡;PI染色流式细胞术(FCM)分析细胞周期和凋亡率.结果:平皿克隆形成法显示:ADFMChR抑制人肝癌(SMMC-7721)细胞生长,且呈浓度依赖性.AO/EB染色荧光显微镜观察发现随着ADFMChR浓度的增加SMMC-7721细胞凋亡率依次增加.PI染色FCM结果表明ADFMChR以浓度依赖方式诱导SMMC-7721细胞凋亡,且使细胞周期阻滞于G1期.结论:ADFMChR具有诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,其机制可能与细胞周期G1期阻滞相关.     

聚肌苷酸胞苷酸对人肝癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

目的 探讨聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721生长的增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨其作用机制.方法 肝癌SMMC-7721细胞经不同剂量Poly I:C作用后,CCK-8法检测细胞增殖抑制,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化,SYBR-Green荧光定量PCR检测TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达.结果 Poly I:C 高剂量组的生长抑制率最高,高、中、低三个剂量组间比较差异有显著性(P<0.05).Poly I:C同一剂量组生长抑制率72 h最高,48 h次之,24 h时最低,每组不同时间点比较差异有显著性(P<0.05).流式细胞仪检测结果 显示Poly I:C可诱导SMMC-7721细胞凋亡,随浓度增加和时间的延长凋亡率逐渐升高(P<0.05).Poly I:C组细胞处于G1期的百分率明显高于对照组.TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达均增高,三组间比较差异有显著性(P<0.05).结论 Poly I:C对体外培养的SMMC-7721有显著的增殖抑制作用,呈剂量依赖性和时间依赖性,其机制可能与细胞周期阻滞,TLR3通路激活,诱导产生IFN-β,诱导细胞凋亡有关.     

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的实验研究

目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人肝癌(SMMC-7721)细胞系,细胞凋亡的生物学效应.方法:通过MTT比色法检测EGCG对SMMC-7721细胞生长的影响;应用细胞计数法研究不同浓度EGCG对SMMC-7721细胞生长曲线的影响;PI染色流式细胞术研究EGCG对SMMC-7721细胞周期和凋亡率的影响.结果:EGCG显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长,呈浓度依赖性;SMMC-7721细胞经EGCG作用后,其细胞群体倍增时间明显延长,细胞增殖周期延长,从而细胞增殖速度减慢;流式细胞术分析结果表明EGCG(30 μg/mL、60μg/mL、120 μg/mL)处理SMMC-7721细胞48 h后,G1期细胞累积均逐渐增加.结论:EGCG具有诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,其机制可能与使细胞周期G1期阻滞相关.     

EGFR抑制剂吉非替尼对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂吉非替尼对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响,为原发性肝癌的分子靶向治疗提供实验依据.方法应用免疫组化法检测SMMC-7721细胞中EGFR的表达,不同浓度吉非替尼处理SMMC-7721细胞48 h后,MTT法检测细胞对该药物敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡变化.结果SMMC-7721细胞中EGFR呈强阳性表达,吉非替尼明显下调EGFR表达,抑制SMMC-7721细胞生长,呈剂量时间依赖性,8 mmol/L吉非替尼组细胞凋亡率为(58.58±2.95)%,显著高于对照组(0.11±0.04)%,(P＜0.01).结论吉非替尼能够通过诱导细胞凋亡抑制SMMC-7721细胞生长,因而有望为肝癌的分子靶向治疗提供新的有效途径.     

香草醛缩氨基均三唑席夫碱对肝癌细胞分化相关酶和蛋白的影响

目的:研究香草醛缩氨基均三唑席夫碱对人肝癌细胞SMMC-7721的诱导分化作用。方法:用不同剂量的3-吡啶-3-基-4-[(4-羟基-3-甲氧基-苯亚甲基)氨基]-5-甲硫基-1,2,4-三唑(LH-37)与SMMC-7721细胞共同培养,以MTT法检测细胞增殖和LH-37对细胞增殖的抑制作用;镜下观察细胞形态改变;采用酶联免疫法检测细胞甲胎蛋白含量,金氏法检测细胞碱性磷酸酶活性的变化。结果:LH-37在1×10-5~1×10-3mol/L的浓度范围均能抑制细胞增殖且抑制率随浓度的的增加而增高(P<0.05或P<0.01),细胞形态和结构向正常肝细胞方向逆转,1×10-5mol/L和1×10-6mol/L的LH-37均可使细胞甲胎蛋白含量明显下降,碱性磷酸酶活性明显升高。结论:香草醛缩氨基均三唑席夫碱对人肝癌SMMC-7721细胞具有抗增殖、促分化作用。     

熊果酸对人肝癌SMMC-7721细胞周期的影响

目的探讨熊果酸（UA）对人肝癌SMMC-7721细胞周期的影响。方法用不同浓度的UA处理SMMC-7721细胞,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期的变化,RT-PCR检测细胞周期相关基因p21、p53及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果 UA对SMMC-7721细胞生长有显著的抑制作用,且此作用呈明显的时间、剂量依赖性;UA可以诱导SMMC-7721细胞阻滞在S期,RT-PCR结果显示其能够上调p21和p53基因,下调PCNA基因。结论 UA能明显抑制SMMC-7721细胞的生长,引起细胞周期阻滞;细胞周期阻滞的发生与p21、p53、PCNA基因变化相关。     

沉默乏氧诱导因子-1α基因对乏氧人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因对CoCl2诱导的乏氧人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响及其机制。方法利用分子生物学技术构建靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF,脂质体介导转染SMMC-7721细胞后进行乏氧培养,分别采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α基因的mRNA和蛋白表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果酶切鉴定和测序证实重组质粒pGenesil-HIF构建正确,转染质粒后乏氧培养24 h,SMMC-7721细胞HIF-1α基因的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组和阴性干扰组（P〈0.05或P〈0.01）;乏氧培养24 h、48 h和72 h后,HIF-1α干扰组细胞增殖活性明显低于对照组（P〈0.05或P〈0.01）,细胞阻滞于G0/G1期（P〈0.01）;乏氧培养48 h和72 h后HIF-1α干扰组细胞凋亡百分率明显高于对照组（P〈0.01）;乏氧培养72 h后HIF-1α干扰组SMMC-7721细胞放射增敏比为1.45。结论 RNA干扰HIF-1α基因可增强乏氧人肝癌细胞SMMC-7721的放射敏感性,其机制可能与RNA干扰HIF-1α基因抑制乏氧细胞增殖和诱导凋亡有关。     

化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210的表达

目的探讨不同浓度CoCl2对人肝癌细胞SMMC-7721乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）和miR-210表达的影响以及RNA干扰HIF-1α基因对miR-210表达的影响。方法采用Western blot法检测不同浓度CoCl2培养24 h后SMMC-7721细胞HIF-1α蛋白表达变化,实时定量PCR检测miR-210相对表达量。脂质体介导靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF转染SMMC-7721细胞后,乏氧培养24、48和72 h,分别采用Western blot法和实时定量PCR检测细胞HIF-1α蛋白表达变化和miR-210相对表达量。结果 50和100μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量与0μmol/L组相比,差异均无统计学意义（均P〉0.05）;150和200μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量均显著高于0μmol/L组（P〈0.05或P〈0.01）。转染质粒pGenesil-HIF后乏氧培养24、48和72 h,细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量显著低于阴性干扰组（均P〈0.01）。结论化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210表达明显上调,RNA干扰HIF-1α基因可明显下调乏氧细胞miR-210表达。     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

腺病毒介导的THANK基因在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建THANK腺病毒载体,观察腺病毒感染后THANK在SMMC-7721细胞中的表达情况.方法:把THANK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒,再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取THANK重组腺病毒,以不同感染复数(MOI)腺病毒感染SMMC-7721细胞,观察腺病毒对SMMC-7721细胞的感染情况.结果:成功地构建了THANK腺病毒,该腺病毒可高效介导THANK在SMMC-7721细胞中表达,基因转染后第5天,THANK表达高于35 ng/ml,且随时间延长增加.结论:腺病毒可诱导THANK基因在SMMC-7721细胞中高表达.     

人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,观察对其增殖影响。方法:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及细胞的克隆形成能力的变化。结果:VEGF shRNA真核表达载体大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,转染后细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;MTT法观察细胞生长速度变慢,单个细胞的克隆形成能力明显下降。结论:VEGF shRNA真核表达载体可明显抑制SMMC-7721细胞增殖能力,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

siRNA介导的NF-κB P65沉默诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡

目的 研究siRNA介导的NF-κBP65沉默诱导肝癌细胞凋亡相关机制。方法实验以肝癌SMMC772l细胞株为材料,分为空白对照（Con）、脂质体对照（LP）以及siRNA干扰实验（siRNA）3组。以体外转录法合成dsRNA,并用脂质体转染SMMC7721细胞株;Westernblotting检测NF．KBP65表达水平,MTT检测细胞增殖情况,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,免疫组化检测Bcl-2和Bax表达。结果与Con和LP组相比,siRNA具有抑制SMMC7721细胞NF-κBP65表达的作用,NF-κBP65表达抑制率分别达到64．74％和34．52％。siRNA明显抑制SMMC．7721细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,晚期凋亡细胞分别是Con组和LP组的8倍和7倍。siRNA引起Bcl-2表达下调,而Bax表达上调。结论siRNA可以有效抑制NF-κBP65蛋白表达,并通过调节Bcl-2和Bax诱导SMMC7721细胞的凋亡。     

Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究

目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响.方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达;通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达;通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况;利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡.Western blot检测下调hsa _circ _0000711后Cyclin D1、CDK4、 cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平.结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC- 7721中明显高表达(P＜0. 05) .与对照组相比,hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P＜0. 05),处于G1期细胞增多(P＜0. 05),且凋亡细胞显著增加(P＜0. 05) .干扰hsa_circ_0000711的表达后,肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P＜0. 05),cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P＜0. 05) .结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖.     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。