节律基因Period1对吗啡依赖效应的影响

目的：研究节律基因Period1在药物精神依赖形成中的作用。方法：设计针对节律基因Period1 mRNA的核酶(per1 RZ)，构建以真核表达质粒pcDNA3．1为基础的perlRZ表达质粒(pcDNA3．1-per1RZ)；体外转录切割实验检测核酶对Period1 RNA的切割作用；脑室注射pcDNA3．1-perlRZ，调节动物节律基因Period1的表达；以BALB／C小鼠的吗啡条件性位置偏爱(CPP)为指标，观察pcDNA3．1-periRZ对吗啡精神依赖形成的影响。结果：体外切割实验发现perlRZ对PeriodlRNA的切割效率达到60％；动物实验证实per1RZ能有效干扰小鼠中枢神经系统Period1基因的表达，阻断吗啡条件性位置偏爱的形成。结论：节律基因Period1与药物精神依赖的形成有关，提示per1RZ可以阻断动物药物精神依赖的形成。     

吗啡依赖及戒断小鼠脑内节律基因mPeriodl表达的研究

目的 研究吗啡依赖和吗啡戒断小鼠脑组织内节律基因mPeriod1（mPer1）表达的变化。方法 以雄性BALB／C小鼠的吗啡条件性位置偏爱为指标，观测吗啡依赖组、吗啡戒断组小鼠与正常盐水组小鼠的药物精神依赖的变化；应用免疫组化SP法检测3组小鼠脑内mPer1的表达情况；利用图像软件对免疫组化结果进行分析和处理。结果 吗啡依赖组的小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组有明显改变。而吗啡戒断组小鼠脑内mPerl表达峰值相位较正常盐水组没有显著性差异。结论 研究结果表明吗啡成瘾影响了以mPer1为重要部件的近日钟的自激振荡过程，使近日节律发生了改变。     

吗啡依赖及戒断小鼠脑内节律基因mPeriod1表达的研究

目的研究吗啡依赖和吗啡戒断小鼠脑组织内节律基因mPeriod1(mPer1)表达的变化。方法以雄性BALB/C小鼠的吗啡条件性位置偏爱为指标,观测吗啡依赖组、吗啡戒断组小鼠与正常盐水组小鼠的药物精神依赖的变化;应用免疫组化SP法检测3组小鼠脑内mPer1的表达情况;利用图像软件对免疫组化结果进行分析和处理。结果吗啡依赖组的小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组有明显改变。而吗啡戒断组小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组没有显著性差异。结论研究结果表明吗啡成瘾影响了以mPer1为重要部件的近日钟的自激振荡过程,使近日节律发生了改变。     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

pEgr-ssEndostatin重组质粒瘤内辐射诱导表达及其抗肿瘤作用

目的 观察pEgr-ssEndostatin基因-放射治疗对移植黑色素瘤B16小鼠的抗肿瘤作用及其在瘤内辐射诱导表达。方法 肿瘤局部注射脂质体包裹的pEgr-ssEndostatin重组质粒后42h，接受20Gyx射线照射，观察放疗后不同时间肿瘤大小，检测放疗后第2天瘤内Endostatin转录水平。结果 pEgr-ssEndostatin基因-放射治疗荷瘤小鼠能够增强放疗疗效；单纯接种pEgr-ssEndostatin质粒组和接种pEgr-ssEndostatin质粒 20Gy照射组小鼠的肿瘤组织内有Endostatin mRNA表达，且pEgr-ssEndostatin质粒照射组的EndostatinmRNA水平高于单纯pEgr-ssEndostatin质粒组。结论 pEgr-Endostatin基因-放射治疗抗肿瘤作用明显优于单纯放疗和单纯基因治疗，肿瘤局部转染重组质粒后照射瘤内Endostatin表达增强。     

东部马脑炎病毒E2基因的表达及DNA免疫的初步研究

目的：构建东部马脑炎病毒E2基因的重组真核表达载体，对其DNA免疫原性进行观察。方法：采用RT-PCR扩增东部马脑炎病毒全长E2基因，构建真核表达载体pcDNA-E2，以脂质体法转染COS7细胞，经蛋白印迹法和免疫荧光法证明E2基因可以表达后，用庐重组质粒DNA免疫Balb/c小鼠，并用免疫荧光法检测鼠血清中病毒的特异抗体。结果：免疫印迹法、免疫荧光法检测表明E2基因在COS7细胞中获得瞬时表达，pcDNA-E2基因免疫小鼠可产生抗东部脑炎病毒的特异抗体。结论：东部马脑炎病毒E2基因的重组质粒DNA可刺激小鼠产生特异性的抗东部马脑炎病毒体液免疫应答，为基因疫苗的研制奠定了基础。     

pEgr-IFNγ重组质粒辐射诱导表达及其抑瘤作用的实验研究

目的 探讨pEgr-IFNγ重组质粒在接种B16黑色素瘤小鼠体内的辐射诱导表达及其抑瘤效应。方法 小鼠肿瘤局部注射脂质体包裹的重组质粒pEgr-IFNγ后36h，接受不同剂量X射线照射，观察各组小鼠照射后不同时间肿瘤生长速率和平均存活时间，照射后第3天用RT-PCR法检测瘤内IFNγ转录水平，照射后第l，3和5天用ELISA法检测小鼠血清中IFNγ含量。结果 照射后第3天重组质粒 20Gy组瘤内IFNγ转录水平明显高于重组质粒组；照射后第l，3天血清中IFNγ含量明显高于重组质粒组和对照组；照射后第9-15天，4次(质粒 5Gy)组小鼠肿瘤生长速率明显低于重组质粒 20Gy组，且平均生存时间明显延长。结论 多次基因-较小剂量放射治疗的抑瘤效应优于单次基因．较大剂量放射治疗；基因-放射治疗组可能通过诱导瘤内IFNγ表达增强，使血液中IFNγ浓度升高，从而提高荷瘤机体免疫功能和抗肿瘤能力。     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

脱氧核酶对Period1 mRNA的体外切割及对小鼠吗啡奖赏效应的影响

目的 研究脱氧核酶对Period1 mRNA的体外切割作用，及注射脱氧核酶对阿片类药物奖赏效应的影响。方法 设计合成针对Periodl (Per1)mRNA的脱氧核酶(DRZ164)，并构建pcDNA3．1( )-Per1164矾体外转录载体；将体外转录产物和脱氧核酶按一定条件混合，检测脱氧核酶的体外切割效率。脑室注射DRz164，建立小鼠条件位置偏爱模型，观察脱氧核酶对吗啡奖赏效应的影响。结果 DRz164对。Per1 mRNA组分有切割作用，在反应30、60、90和120min的剪切百分率分别为36．4％、40．5％、47．8％和63％。给予DRz164后小鼠未能形成对吗啡的位置偏爱。结论 DRz164矾在体外能够切割per1 mRNA，在一定范围内剪切活性随时间延长而升高，小鼠脑室注射DRz164可拮抗吗啡所引起的奖赏效应，缓解对吗啡的精神依赖。     

糖皮质激素对吗啡依赖大鼠海马c-fos基因表达的影响

目的 观察吗啡依赖大鼠脑内海马区c-fos mRNA水平的变化,研究糖皮质激素(地塞米松)控制阿片戒断症状的分子机理。方法 剂量递增腹腔注射吗啡建立大鼠成瘾模型,给与地塞米松干预,纳洛酮促瘾后观察戒断症状,应用原位杂交方法观察海马区c-fos mRNA。结果 吗啡依赖大鼠经地塞米松干预后,由纳洛酮催促戒断症状评分明显低于未经地塞米松处理组;同时经地塞米松干预后,海马c-fos mRNA的表达量明显低于未经地塞米松处理,但较盐水对照组高。结论糖皮质激素(地塞米松)能抑制吗啡依赖大鼠戒断症状以及海马c-fos mRNA的表达。     

hOGG1核酶介导的肺癌细胞对60Coγ射线放射敏感性的研究

目的 观察 ⁶⁰Co γ 射线对核酶诱导的hOGG1基因低表达的人肺腺癌A549细胞的损伤效应,探讨hOGG1低表达在增加肿瘤细胞放疗敏感性中的作用机制。方法 以A549细胞、转染空质粒的A549-P细胞和转染hOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体pcDNA3.1(+)-RZ的A549-R细胞为研究对象,测定射线照射后3种细胞活性氧含量、细胞存活率、细胞染色体损伤及DNA损伤和修复的差异。结果 A549、A549-P和A549-R 3种细胞的存活率随 ⁶⁰Co γ 射线照射剂量的增加而下降,存在较好的剂量-反应关系(r =-0.984、-0.978、-0.975, P＜0.05)。A549-R细胞的IC₅₀(9.37±0.24)显著低于A549细胞(12.98±0.44),差异有统计学意义(t=-12.48, P＜0.05)。 ⁶⁰Co γ 射线照射下细胞活性氧含量、微核形成率及DNA损伤均增加,在相同剂量下,A549-R细胞中活性氧含量和微核形成率均高于A549和A549-P细胞。此外,在相同照射剂量下,hOGG1缺陷的A549-R细胞的DNA损伤较A549和A549-P细胞严重,且损伤后更加不易修复。结论 ⁶⁰Co γ 射线可以诱导A549、A549-P和A549-R 3种试验细胞的活性氧增加,从而导致DNA和染色体损伤,最终使细胞存活率降低,且以hOGG1低表达的 A549-R细胞更为明显,提示hOGG1基因的低表达可能增加肿瘤细胞对射线的敏感性。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达

目的 :构建人胰岛素样生长因子 - 1(hIGF - 1)真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用DNA重组方法将编码hIGF - 1cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(- )中 ,构建pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1瞬时转染C2C12成肌细胞中 ;采用RT -PCR及免疫组化染色等方法检测hIGF - 1基因在成肌细胞中的表达情况 ;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hIGF - 1的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1转染成肌细胞后 ,hIGF - 1mRNA及蛋白表达水平明显增高 ;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hIGF - 1蛋白的表达 ,所表达出hIGF - 1蛋白具有生物学活性。     

天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达.方法 采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆.用Western blot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达.结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确.Western blot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达.结论 天然溶瘤型NDV Italien株的HN cDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达.     

PSP94—TNFαD11a质粒DNA注射体内表达规律

将带有目的基因PSP94－TNFαD11a的pcDNA3.0质粒DNA，以50μg／只剂量注射到39只雄性昆明小鼠的股四头肌内，第2、3、4、5、10、15、20、25天分别摘眼球取血收集血清，每组3只动物血清混合。同时取注射部位骨骼肌，研磨后离心取上清。用ELSIA方法检测血甭和骨骼骨上清中融合蛋白的表达，观察不同时间的蛋白表达水平。提取14天骨骼肌组织的总RNA，进行RT－PCR分析目的的基因mRNA的表达水平。结果，在裸质粒注射后9天可检出目的蛋白的表达，第14天出现表达高峰，观察至25天仍可检察到蛋白表达。     

重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体（hTSHR）体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达 的变化.方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5a感受态菌,进行扩增、酶切,再以核苷酸测序方法鉴定.体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测TSHR表达产物,井型γ计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性.采用SPSS 13.0软件,对计量资料行t检验.结果pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn Ⅰ和Xha Ⅰ双酶切：hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb,pcDNA3.1（＋）的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1（＋）细胞比较：（1）在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,（2）前者125 I摄取率是后者的2.9倍（t=28.63,P＜0.01）,（3）甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体（NIS）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Tg的mRNA的表达分别升高1.74倍（t=5.959,P＜0.01）、7.2倍（t=3.807,P＜0.05）、2.88倍（t=4.769,P＜0.01）和2.67倍（t=6.388,P＜0.01）.结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据.     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板,应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。     

tTSF基因的酵母表达及其基因治疗研究

目的 选择PF4，TSP1的高活性片段及肿瘤细胞靶向肽，设计合成融合基因—tTSF，进行酵母表达及小鼠基因治疗研究。方法 根据PF4和TSP1的抑制血管生成高活性片段设计合成TSF基因，并在N-端接上肿瘤细胞靶向肽，设计合成了tTSF。将tTSF基因构建到pPIC9质粒，重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株进行表达，并检测表达产物对血管内皮细胞生长的抑制作用。将tTSF基因克隆到pcDNA3．1（＋）载体，重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF通过皮下注射治疗C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌。结果 重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株后，获得了tTSF的高效表达，表达产物对血管内皮细胞生长产生明显的抑制作用；皮下注射重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF后，C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌的生长受到明显抑制。结论 tTSF基因设计成功，其酵母表达产物对血管内皮细胞生长产生具有明显的抑制作用，tTSF基因的体内基因治疗也具有显著的抗肿瘤效应。