非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究

诱导多能性干细胞（iPSC）技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用。非整合质粒（Episomal）方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的最佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用。本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞（CBMNC）重编程为诱导多能性干细胞（iPSC）,建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础。利用CBMNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episo—mal方法进行优化。结果表明：CBMNC采用红系培养液,培养8d,使用启动子为sFFV（spleen focus forming virus）的Episomal载体,在低氧（3％）条件下诱导,CBMNC重编程效率最高,可达到0．12％。通过分析最佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36＋CD71＋CD235alow的有核红细胞是重编程最主要的供体细胞来源。结论：本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术。     

诱导性多能干细胞在遗传性心脏病实验研究中的应用

人类诱导性多能干细胞(iPS 细胞)的建立是目前最重要的科技进展之一。近年来,iPS 细胞应用于遗传性心脏病细胞模型的建立,及其iPS 细胞治疗动物心梗模型成功,为探索遗传性心脏病的发病机制和治疗带来了光明前景。     

Induced Pluripotent Stem Cells: The Most Versatile Source for Stem Cell Therapy

Cell therapy has existed since the first bone marrow transplant in the 1950s involving identical twins. The blood-forming stem cells were used to restore healthy blood cells for the twin with leukemia. It was not until 1968 that genetic matching (known as human leukocyte antigen matching) was known to be important, and not until 1973 that bone marrow transplants were performed from non–twin-related and nonrelated donors. The most important application of human stem cells is for the generation of cells and tissues for cell-based therapies. Currently, donated organs and tissues are often the only option to replace diseased, injured, or destroyed tissue. The availability for these transplantable tissues and organs is very limited, however. To satisfy the demand for a source for these cells and tissues, induced pluripotent stem cells that have been differentiated into specific cell types can serve as a renewable source of replacement cells and tissues. A bank of suitable human leukocyte antigen–matched cells will be an important source providing immediate availability of cells that are readily scalable, economical, and well characterized. Areas of active pursuit with stem cell therapy is being investigated for treating diseases such as macular degeneration, spinal cord injury, stroke, burns, heart disease, diabetes, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, and neurodegenerative diseases. This article describes the advantages and hurdles for the use of induced pluripotent cells as the starting material for a source of replacement cells for regenerative medicine.     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

胰岛素样生长因子-1参与诱导小鼠诱导多潜能干细胞的研究

目的:观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对小鼠诱导多潜能干(iPS)细胞诱导效率的影响。方法:将鼠胚成纤维细胞分为对照组和实验组,2组均予经典四因子的逆转录病毒载体感染,实验组在培养基里加入IGF-1,进行iPS细胞诱导,并对其进行鉴定。结果:对照组和实验组的iPS细胞诱导效率分别为(0.05±0.0002)%和(0.01±0.0005)%,所获iPS细胞为阳性。结论:IGF-1提高小鼠iPS细胞的诱导效率。     

神经节苷脂体外诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨神经节苷脂体外诱导骨髓基质干细胞（BMSC）向神经元样细胞分化的可能性。方法分离培养人BMSC，采用含神经节苷脂的无血清培养基诱导BMSC的分化，免疫细胞化学方法鉴定诱导分化后细胞表面神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）的表达。结果神经节苷脂诱导培养6h后，细胞表现为典型神经细胞样形态，神经元特异性标志物NSE和NF呈阳性表达。结论神经节苷脂可在体外诱导人BMSC分化为神经元样细胞。     

Application of Epigenome‐Modifying Small Molecules in Induced Pluripotent Stem Cells

Recent breakthroughs in generating induced pluripotent stem cells (iPSCs) using four defined factors have revealed the potential utility of stem cells in biological research and clinical applications. However, the low efficiency and slow kinetics of reprogramming related to producing these cells and underlying safety issues, such as viral integration and genetic and epigenetic abnormalities of iPSCs, hamper the further application of iPSCs in laboratory and clinical settings. Previous studies have suggested that reprogramming efficiency can be enhanced and that reprogramming kinetics can be accelerated by manipulating epigenetic status. Herein, we review recent studies on the application of epigenome‐modifying small molecules in enhancing reprogramming and functionally replacing some reprogramming factors. We mainly focus on studies that have used small molecules to interfere with epigenome‐modifying enzymes, such as DNA methyltransferase, histone acetyltransferase, and histone methyltransferase. The potential use of these small molecules in inducing iPSCs and new ways to identify small molecules of higher potency and fewer side effects are also discussed.     

成人脂肪间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的 体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）分化为心肌样细胞，为心肌细胞的替代治疗提供新的来源。方法 采用消化法和贴壁培养法分离培养ADMSCs，对第3代细胞进行免疫化学鉴定和5-氮杂胞苷（5-aza）诱导，于诱导后第7、14、21和28天行免疫化学鉴定．并测定GATA4和Nkx2．5表达和心房利钠肽（ANP）含量。结果 人脂肪中含有梭形细胞，CD44、CD13、CD105阳性表达，而CD45、CD34、HLA-DR、Ⅷ因子阴性表达。诱导后细胞排列方向一致．部分细胞聚集成团；结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、肌球蛋白重链和心肌肌钙蛋白T呈阳性表达。有GATA4和Nkx2．5的表达及心房利钠肽的分泌。结论 成人脂肪组织中含有问充质干细胞，且可在5-氮杂胞苷诱导21d后分化为心肌样细胞。     

人参皂苷Rg1参与诱导小鼠多潜能干细胞的研究

目的:观察人参皂苷Rg1对鼠胚成纤维细胞(MEF)向诱导多潜能干细胞(iPSCs)诱导转化效率的影响。方法:采用经典四因子的逆转录病毒载体感染,在细胞感染后3 d内在MEF培养基里加入人参皂苷Rg1(0、0.3、1、3、10μg/mL),进行iPSCs诱导及鉴定。结果:人参皂苷Rg1(1μg/mL)组可明显提高iPSCs的诱导效率,诱导效率为(0.0450±0.0019)%,人参皂苷Rg1(0μg/mL)组为(0.0100±0.0033)%,所获iPSCs经鉴定为阳性。结论:人参皂苷Rg1可能在提高小鼠iPSCs的诱导效率方面发挥一定作用。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

人脐带源神经干细胞的培养和分化

目的研究诱导人脐带间充质干细胞(hucMSC)分化为神经干细胞样细胞(hucNSC)的方法。方法体外培养hucMSC,流式细胞仪鉴定细胞表型的表达。用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子添加B27诱导,流式细胞学、免疫细胞化学鉴定。用胶质源性神经营养因子(GDNF)、白介素-1β(IL-1β)和全反式维甲酸(ATRA)等诱导分化,免疫组化染色、RT-PCR鉴定。结果hucMSC表达CD105、CD44、CD29。诱导后聚集成细胞球悬浮生长,并不断增殖,流式细胞仪鉴定失去hucMSC的表面标志物特征,而表达Nestin、CD133。再经RA、GDNF、IL-1β诱导,细胞表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和酪氨酸羟化酶。结论hucMSC能分化为具有神经干细胞样生长、增殖、分化特征的细胞。     

腐胺促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

目的:探索腐胺对人骨髓间充质干细胞(MSC)增殖分化的影响,以期建立一种新的MSC成骨分化诱导体系。方法:采集3份健康人骨髓MSC,应用MTT实验检测腐胺对细胞增殖的影响。实验分为:1腐胺组(100μmol/L腐胺),2阳性对照组(加入以地塞米松、抗坏酸磷酸盐和β-磷酸甘油组成的标准诱导体系),3阴性对照组(未加腐胺体系),MSC培养1周后应用PCR法检测细胞Runx-2表达水平,2周后进行碱性磷酸酶原位组织化学染色,并将部分细胞裂解后测定细胞碱性磷酸酶活性及蛋白质浓度。此外,以标准成脂分化诱导体系为阳性对照,MSC培养体系中加入腐胺,培养2周后油红O染色,观察腐胺诱导MSC成脂细胞分化作用。结果:在一定范围内腐胺促进人骨髓MSC增殖,且效应呈浓度依赖性。腐胺(100μmol/L)培养MSC 1周后,细胞Runx-2表达水平显著增加;2周后,组织化学染色显示,细胞呈现明显的碱性磷酸酶活性,单位细胞蛋白质浓度内酶活性显著高于阴性对照组(0.87±0.012 vs 0.52±0.010)(P0.01),也明显高于阳性对照组(0.83±0.029)(P=0.02)。在该浓度下,油红O染色显示腐胺组MSC未发生脂肪细胞分化。结论:腐胺可促进MSC增殖并促使其向成骨细胞分化,可作为MSC体外成骨细胞分化新诱导成分之一。     

间充质干细胞的衰老对其免疫调控能力的影响

本研究旨在探讨人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UB-MSC)的衰老对其免疫调控能力的影响。从人脐带中分离MSC并进行传代培养,通过形态学观察其核质比的变化。分别选取第5代(对照组)及第13代(衰老组)MSC进行研究,运用细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒进行衰老检测,并采用CCK-8细胞计数试剂盒检测MSC对淋巴细胞增殖能力的影响,最后通过RT-PCR方法检测免疫调控相关基因在衰老MSC的表达情况。研究结果表明,随传代次数增加,MSC的长宽比增大,核质比减小。细胞衰老检测结果显示,第13代MSC的衰老细胞比例明显增加,但在体外混合淋巴细胞培养体系中,第13代MSC对淋巴细胞增殖的抑制作用与第5代相比明显增强(P<0.05),且第13代细胞免疫抑制相关基因表达增加,促炎相关基因表达减弱。结论:脐带间充质干细胞随体外培养代数增加而逐渐衰老,但免疫抑制能力逐渐加强。     

间充质干细胞与相关因子

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及成肌细胞分化的多向潜能，可在造血微环境形成、组织修复及基因治疗中得到应用。多种生长因子如TGF—β，IGF—I，BMP及FGF在MSC分化中发挥不同的促进作用并有协同性；MSC可分泌G—CSF，SCF，LIF，M—CSF，IL—6和IL—11等多种细胞因子支持造血并与某些疾病的发生有关；相关因子作用后的MSC将在基因工程应用中发挥重要作用。     

人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子

为了研究培养的人骨髓间充质干细胞在造血中的生物作用，采用RT—PCR方法在mRNA水平上分析体外培养的人骨髓间充质干细胞(BM—MSC)造血因子的表达，以及氢化考的松对BM—MSC表达造血细胞因子的影响。结果显示，体外传代培养的正常人、白血病和淋巴瘤等血液病人BM—MSC均能表达SCF，Flt3-ligand TPO,LIF,IL—6和IL—11等重要的造血细胞因子，但不表达G—CSF，GM—CSF和IL-3。不同代数的BM—MSC细胞，造血细胞因子的表达相同。BM—MSC经氢化考的松作用7—21天后，可谤手G—GSFmRNA表达，但不诱导GM—GSF的表达，细胞在形态学上也未发生明显改变。结论：体外培养的正常人和本组血液病病人BM—MSC具有促造血功能。     

人骨髓间充质干细胞原位冷冻保存方法的改进

本研究的目的是分离纯化、大量扩增人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)。在细胞原住冻存后通过鉴定其生物学特性有无变化。以探讨这种原位冻存方法的可行性。采用常规方法体外分离培养并扩增骨髓MSC，将培养扩增的细胞用含10％二甲亚砜、30％胎牛血清、DMEM—LG的细胞冻存体系，以不同的细胞贴壁密度在细胞培养瓶内原住冻存于-70℃冰箱内。冻存后第4，8和12周在38℃至40℃的水浴中复苏冻存的贴壁细胞，通过细胞周期分析并检测其多向分化功能以鉴定该方法的可行性。结果表明，MSC不经消化，直接在培养瓶内原住冻存于-70℃低温冰箱，3个月内细胞生物学特性没有明显改变，细胞仍具有向成骨、脂肪和成软骨细胞多向分化的能力。结论：体外培养的骨髓MSC原住贴壁冻存于-70℃。至少在12周内不影响其生物学功能，此种短期冷冻保存是一种可行的方法。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件。方法无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esencu ltTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11 a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致。结论源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床。     

骨髓间充质干细胞对大鼠到小鼠胰岛移植的保护作用

目的 探讨同种异基因骨髓间充质干细胞(bone mesenchamal stem cells,BMSC)静脉输注对大鼠到小鼠胰岛移植物的功能保护和小鼠糖尿病状态改善.方法 全骨髓培养法获得C57BL/6小鼠BMSC.不连续梯度离心法分离纯化Sprague-Dawley(SD)大鼠胰岛,将300胰岛当量的胰岛单独或与BM...     

人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离及其生物学特性研究

胎盘来源间充质干细胞（mesenchymal stem cells,,MSC）与骨髓间充质干细胞相比,具有来源充足、免疫原性低、病毒污染率较低,且无社会伦理争议等方面的优点,使其具有更好的临床应用前景。胎盘组织不但包括来自母体的绒毛膜组织、羊膜组织,还包括来自母体的底蜕膜组织,但底蜕膜来源间充质干细胞生物学特性还需要进一步研究探讨。我们使用酶消化法分离底蜕膜来源间充质干细胞,通过短串联重复序列分析（STR）检测细胞是否均来源于母体组织,用MTT法检测细胞生长方式,流式细胞仪分析细胞周期和细胞表型,使用不同的诱导分化培养基检测其多向分化的能力。然后将底蜕膜间充质干细胞细胞与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养,用酶联免疫吸附试验检测上清γ-干扰素的水平。结果表明：短串联重复序列分析证明所得到的细胞均来源于母体组织,底蜕膜细胞生长呈典型的成纤维细胞形态。细胞表达常见的间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105、CD44,不表达CD45,CD11b和CD34。在不同的条件培养基培养状态下,细胞均可向成骨、成脂和成软骨方向分化。结论：从胎盘底蜕膜获得的细胞,具有间充质干细胞的基本特征,是底蜕膜间充质干细胞。底蜕膜间充质干细胞能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素,这使得底蜕膜间充质干细胞作为一个母亲自体间充质干细胞的重要来源,能安全的用于治疗母亲的免疫系统疾病。