戊二醛交联提高胶原/壳聚糖真皮支架抗细胞收缩能力的研究

目的 应用交联处理的胶原支架,来减缓其降解过多、易收缩变形、机械性能不足等缺点.方法 采用冷冻-冻干法构建胶原/壳聚糖多孔支架,并通过戊二醛交联构建具有良好抗细胞收缩稳定性和细胞相容性的胶原支架.通过测定不同培养时间各类支架的尺寸变化,研究了戊二醛交联对支架抗细胞收缩能力的影响.结果 戊二醛交联后的胶原/壳聚糖支架未见明显收缩,其细胞活性也始终高于干热交联支架.结论 戊二醛能有效地提高胶原基支架的抗细胞收缩能力,并保持其良好的生物相容性.     

胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架材料的制备及其生物相容性检测

目的制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石(collagen-chitosan/nano-hydroxyapatite-collagen-polylactic acid,Col-CS/nHAC-PLA)仿生支架材料,检测生物相容性,为其在骨软骨缺损修复中的应用奠定基础。方法以1,4二氧六环为溶剂,按8%质量浓度加入PLA和等量nHAC溶解,制备nHAC-PLA;用2%醋酸溶液配制浓度为2%的CS纯溶液及1%的Col纯溶液,以质量比(M/M)20∶1混合,倒入含nHAC-PLA的模具中,冷冻干燥成形制备Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。行急性全身毒性实验、皮内刺激实验、热源实验、溶血实验、体外细胞毒实验、骨植入实验,评价其生物相容性。结果 Col-CS/nHAC-PLA仿生支架无急性全身毒性;皮内刺激实验示原发刺激指数为0分,为极轻微刺激;热原实验示3只实验动物体温升高均<0.6℃,体温升高总和<1.3℃,符合规定标准;溶血实验示平均溶血率为1.38%,符合≤5%标准。体外细胞毒性实验示材料浸提液不影响兔BMSCs增殖,毒性分级为Ⅰ级。骨植入实验显示支架材料与周边组织相容性好。结论 Col-CS/nHAC-PLA仿生支架材料具有良好生物相容性,有望成为较理想的组织工程骨软骨支架。     

凋亡在骨关节病发病机制中的作用

目的观察凋亡细胞在骨关节病关节软骨中的分布并探讨凋亡与骨关节病的关系。方法用原位杂交及原位末端标记技术,对临床经过石蜡包埋的骨关节病关节软骨标本定位检测Ｘ型胶原表达及凋亡。结果关节软骨损伤后,出现软骨退变变性,簇集软骨细胞群表达Ｘ型胶原（似肥大软骨细胞）,同时存在凋亡。结论凋亡可能在骨关节病发病机制中起重要作用,与骨关节病预后关系密切。     

不同材料人工真皮支架修复猪Ⅲ度烧伤创面比较

目的 比较胶原壳聚糖真皮支架、胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架及脱细胞基质真皮支架移植于Ⅲ度烧伤创面后,真皮支架的血管化及支架上表皮移植修复创面情况.方法 将3种不同真皮支架各移植于6头猪(共18头猪)Ⅲ度烧伤清创后创面,在植入后1、2、3周对真皮支架血管化、创面、支架上表皮移植愈合和修复情况进行观察,同时用免疫组织化学方法,对CD34阳性信号(新生血管数目)进行检测.以无支架植入的Ⅲ度烧伤清创后创面为对照.结果 胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入后2周支架血管化已基本完成,而胶原壳聚糖和脱细胞基质真皮支架至少需要3周.3种不同材料支架垂直于创面的新生微血管均比无支架对照创面多;不同材料支架组与对照组2周创面比1周创面、3周创面比2周创面CD34的表达均明显增多,胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架组植入后1、2、3周CD34阳性信号均明显高于相对应的其他3组;胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入后1周,创面植表皮,移植表皮存活良好,而胶原壳聚糖和脱细胞基质真皮支架植入需要2周,其表面移植的表皮细胞才能成活.结论 3种材料的支架均可修复Ⅲ度烧伤创面,而以胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架的血管化程度最好.     

聚乳酸-羟基乙酸编织网/胶原-壳聚糖真皮替代物的设计及生物学性能初步评价

目的 设计并构建一种含有编织网的连续性真皮再生模板,并初步评价其生物学性能.方法 采用冷冻-冻干法将聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)编织网整合到胶原-壳聚糖支架(CCS)中,形成PLGA编织网/胶原-壳聚糖复合支架(PCCS),对比PLGA编织网、PCCS、CCS微观形态及机械强度.将PCCS及CCS分别埋植于18只SD大鼠皮下(PCCS组、CCS组,每组9只大鼠).术后1、2、4周取埋植部位皮肤标本,行组织形态学观察及免疫组织化学观察(用CD68抗体对巨噬细胞染色),蛋白质印迹法检测CD68、髓过氧化物酶(MPO)、IL-1β、IL-10的蛋白含量.对数据行单因素方差分析和t检验.结果 含有编织网的PCCS具有类似CCS的三维多孔结构;PLGA编织网与PCCS的机械强度分别为(3.07±0.10)、(3.26±0.15)MPa,明显优于CCS[(0.42±0.21)MPa,F=592.3,P＜0.0001].PCCS组约在术后2周完成全层组织长入,CCS组于术后4周才实现这一过程.PCCS组、CCS组均出现巨噬细胞聚集的现象,在术后2周达到高峰,且CCS组可见更多数量的巨噬细胞浸润.术后2周,PCCS组IL-10蛋白含量高于CCS组,而CD68、MPO、IL-1β蛋白含量则低于CCS组(t=-4.06～2.89,P＜0.05或P＜0.01).结论 支架的三维结构与机械强度之间的相互作用,在诱导组织再生中非常重要.PCCS连续性真皮再生模板具有优良的机械性能,合适的三维多孔结构和快速诱导组织、细胞及血管长人的潜能,作为真皮替代物具有一定应用前景.

Abstract：

Objective To design and construct a kind of dermal regeneration template with mesh,and to preliminarily evaluate its biological characteristics. Methods PLGA mesh was integrated into CCS with freeze-drying method for constructing PLGA mesh/CCS composite (PCCS). The micromorphologies and mechanical properties among PLGA mesh, CCS, and PCCS were compared. PCCS and CCS was respectively implanted into subcutaneous tissue of SD rats(PCCS and CCS groups, 9 rats in each group). The tissue samples were collected at post operation week (POW) 1, 2, and 4 for histopathological and immunohistochemical observation. Protein levels of CD68, MPO, IL-1 β, IL-10 were examined by Western blot, with expression of gray value. Data were processed with one-way analysis of variance and t test. Results Threedimensional porous structure of PCCS was similar to that of CCS. Mechanical property of PLGA mesh and PCCS was respectively (3.07 ±0. 10), (3.26 ±0. 15) MPa, and they were higher than that of CCS [(0.42 ±0.21) MPa, F = 592.3, P ＜ 0. 0001)]. The scaffolds were filled with newly formed tissue in PCCS group at POW 2, while those in CCS group were observed at POW 4. A large accumulation of macrophages was observed in both groups, especially at POW 2, and more macrophage infiltration was observed in CCS group. The protein level of IL-10 in PCCS group at POW 2 was obviously higher than that in CCS group, while the protein levels of CD68, MPO, IL-1 β were significantly decreased as compared with those in CCSgroup (with t value from -4.06to2.89,P ＜0.05orP ＜0.01). Conclusions PCCS has excellent mechanical property with appropriate three-dimensional porous structure. Meanwhile, it can rapidly induce formation of new tissue and vascularization, and it has a prospect of serving as a dermal substitute.     

不同人工真皮支架在修复Ⅲ度烧伤创面中创面收缩和细胞凋亡差异的实验研究

目的 探讨不同真皮支架血管化对Ⅲ度烧伤创而修复中创面收缩和细胞凋亡影响的差异.方法 将胶原-磺化羧甲基壳聚糖、胶原-壳聚糖及脱细胞基质三种真皮支架分别移植于猪Ⅲ度烧伤清创后创面,观察植入创面的修复情况,并通过免疫组化、末端脱氧核苷酸介导的生物索化的脱氧尿嘧啶DNA切口末端标记等方法对不同时间小同支架创面中表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的血管和肌成纤维细胞数量及细胞凋亡情况进行检测.结果 植入不同真皮支架的创面与无支架植入的肉芽创面不同.支架植入创面1～3周α-SMA表达阳性的血管数持续增加,支架植入2周加植表皮2周后创面血管数减少,不同时间点以胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入创面最多,无支架植入创面最少.α-SMA表达阳性的肌成纤维细胞以胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入创面最少且表达高峰为2周,其他创面表达高峰为3周,以无支架植入创面最多.不同支架植入后2～4周,创面内细胞凋亡持续大幅增多;而无支架植入创面中,3～4周才开始增加;细胞凋亡以胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架创面最多,无支架创面最少.结论胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架可增强修复细胞的迁移,获得良好的血管化,较好较快地修复皮肤全层烧伤缺损创面.     

壳聚糖与型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的　探讨采用壳聚糖与 型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测。　方法　将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0 .2 mol/ L 醋酸溶液制成2 %溶液,高纯度猪 型胶原溶于0 .5 m ol/ L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与 型胶原复合支架。采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性。　结果　制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加。扫描电镜显示壳聚糖与 型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径10 0～2 5 0 μm。各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快。　结论　壳聚糖与 型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架。其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建。     

胶原-硫酸软骨素-透明质酸真皮支架材料修复兔角膜基质缺损的研究

目的探讨以角膜基质细胞与胶原-硫酸软骨素-透明质酸（Collagen-chondroitin sulfate-hyaluronic acid,Co-CS-HA）真皮支架材料复合共培养构建组织工程化角膜基质的可行性,为寻找理想的组织工程角膜支架提供依据。方法先行制备Co-CS-HA真皮支架材料,对其进行扫描电镜、孔隙率、体外降解性、力学性能和细胞增殖的检测和分析。培养兔角膜基质细胞,将其与上述材料复合共培养构建组织工程角膜基质,行兔角膜板层移植。术后大体观察植片和新生血管状况,并于术后第8周取材行组织学观察。结果所制备的Co-CS-HA真皮支架材料为白色海绵状结构,其孔径为（109±11）μm,孔隙均匀并有广泛的交通孔,孔隙率为（94.75±0.39）%。体外降解性和力学性能检测结果显示材料的强度和抵抗酶解的能力显著提高。MTS结果表明,材料对角膜基质细胞的增殖有明显促进作用。兔角膜板层移植后,组织工程角膜植片与宿主角膜组织相融性良好,能够部分修复并填充角膜基质缺损,但直到8周取材时仍留有大量的角膜新生血管。结论本实验室制备的Co-CS-HA真皮支架材料符合支架材料的理化和生物学要求,可一定程度修复兔角膜基质缺损,但在维持角膜的透光度方面仍存有缺陷,眼科应用还需进行更深入研究。     

三种胶原-壳聚糖多孔支架组织相容性的初步研究

目的制备3种具有良好稳定性的胶原-壳聚糖多孔支架,初步探讨其植入体内后的组织相容性。方法冻干法制备胶原-壳聚糖多孔支架,分别采用真空干热和戊二醛对其交联,制备未交联(材料1)、真空干热交联(材料2)和戊二醛交联(材料3)3种胶原-壳聚糖多孔支架,扫描电镜观察支架微观结构。将12只家兔随机分为4组(n=3),3种支架材料分别交叉埋植入12只家兔耳背部皮下,术后观察、记录全身情况及手术区变化,分别于术后3、7、14及28 d组织切片下见3种材料的稳定性和组织相容性。结果扫描电镜下见3种支架均具有三维多孔结构,孔径分别为120±10、80±15和170±20μm,孔隙率均大于90%。大体观察:实验家兔术后全身情况良好,手术区红肿轻微,切口均愈合良好。组织学观察:材料1降解吸收迅速,能引起明显的炎性反应,材料2降解较快,炎性反应不及材料1明显,材料3降解较慢,炎性反应轻微,术后组织再生较快。结论胶原-壳聚糖多孔支架具有适合组织再生的三维多孔结构,交联能提高胶原-壳聚糖多孔支架的早期稳定性和组织相容性,戊二醛交联优于真空干热交联。     

不同浓度配比的壳聚糖-胶原复合材料对细胞亲和性的影响

目的评价不同浓度配比的壳聚糖-胶原支架材料对细胞亲和性的影响,并观察在细胞-支架复合物培养过程中支架材料的物理性质变化情况。方法采用第3代正常人皮肤成纤维细胞作为种子细胞,进行体外培养和扩增至足够数量后,分别种植于100%胶原(实验组1)、70%胶原(壳聚糖∶胶原=3∶7,实验组2)、50%胶原(壳聚糖∶胶原=5∶5,实验组3)、30%胶原(壳聚糖∶胶原=7∶3,实验组4)四种不同浓度配比的壳聚糖-胶原复合支架材料上,培养7d,通过光镜、电镜等观察和比较细胞在支架上的黏附情况、增殖活力和生长形态,以及材料物理强度的变化情况。结果不同浓度的各组壳聚糖-胶原支架材料上,细胞均能黏附、生长良好,其中实验组2的多孔支架材料上细胞增殖更接近单纯胶原材料(实验组1),且材料收缩降解速度明显低于其他2组。结论不同浓度配比的壳聚糖-胶原支架材料中,壳聚糖∶胶原=3∶7的复合支架材料具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且材料形变相对较小。     

胶原-壳聚糖真皮支架原位诱导修复猪全层皮肤缺损的研究

目的 观察胶原-壳聚糖真皮支架移植于猪皮肤缺损创面后支架的血管化及血管化支架上皮肤移植的成活情况.方法 将双层人工皮肤支架移植于10只猪全层皮肤缺损创面,在植入后1、2、3周对真皮支架血管化、创面、血管化支架上皮肤移植愈合情况进行观察;同时用免疫组织化学方法,对CD34阳性信号(新生血管数目)进行检测.结果 支架植入后1周支架内可见细胞浸润和少量新生微血管形成;植入后2周,垂直于创面的新生微血管明显增多;植入后3周,大部分支架被血管化.CD34阳性信号在支架植入后3周比植入后2周明显增多,植入后2周比植入后1周明显增多.在支架植入后1、2、3周创面植中厚皮,植皮2周后皮片存活率分别为10%、70%和100%.在支架植入后1周和2周创面植表皮,1周和2周后移植表皮存活良好.结论 胶原-壳聚糖真皮支架可以诱导血管长入,明显促进创面愈合.在支架上移植表皮,可较好修复创面,在皮肤移植中有良好的应用前景.     

人工真皮结合角质形成细胞修复猪皮肤缺损

目的探索胰蛋白酶分离香猪角质形成细胞膜片的最佳方案,在胶原-壳聚糖人工真皮支架创面上进行角质形成细胞体内培养,明确该方法修复猪创伤全层皮肤缺损的实用性。方法用不同皮肤厚度、胰蛋白酶浓度和分离温度分离出角质形成细胞,把有活力的角质形成细胞接种于人工真皮支架植入后1周的全层皮肤缺损创面,2周后对创面愈合进行观察并作病理检测。结果在37℃条件下用0.20%的胰蛋白酶消化1mm厚度皮片100分钟为最佳分离方案。2周后肉眼和病理切片均显示接种的角质形成细胞膜片成活并完全覆盖修复创面。结论应用角质形成细胞体内培养加人工真皮支架制成＂人工皮肤＂能较好的修复猪创伤全层皮肤缺损,抑制创面收缩和瘢痕形成。     

Mesenchymal stem cells combined with an artificial dermal substitute improve repair in full-thickness skin wounds

Autografts represent the gold standard for the treatment of full thickness burns. Factors such as lack of suitable donor sites and poor skin quality, however, have led to the development of artificial dermal substitutes. The investigation of mechanisms leading to enhanced functionality of these skin substitutes has been attracting great attention. This study aimed to investigate the effect of autologous stem cells on the integration and vascularization of a dermal substitute in full-thickness skin wounds, in a murine model. Two cell populations were compared, whole bone marrow cells and cultivated mesenchymal stem cells, isolated from mice transgenic for the enhanced green fluorescent protein, which allowed tracking of the transplanted cells. The number of cells colonizing the dermal substitute, as well as vascular density, were higher in mice receiving total bone marrow and particularly mesenchymal stem cells, than in control animals. The effect was more pronounced in animals treated with mesenchymal stem cells, which located primarily in the wound bed, suggesting a paracrine therapeutic mechanism. These results indicate that combining mesenchymal stem cells with artificial dermal substitutes may represent an important potential modality for treating full thickness burns, even in allogeneic combinations due to the immunoregulatory property of these cells.     

一体式覆膜支架在腹主动脉腔内修复中的应用

目的:总结一体式覆膜支架在腹主动脉以及髂动脉病变中的应用效果。方法:回顾性分析应用一体式腹主动脉覆膜支架腔内修复腹主动脉瘤15例、髂动脉瘤5例及腹主动脉或髂动脉夹层5例的临床资料。结果:平均时间42.4 min,手术成功率100%(25/25)。术后无I、III型内漏,发生髂动脉血栓形成1例,围术期无死亡病例。随访3~16个月复查无动脉瘤复发和II型内漏。结论:一体式覆膜支架是腹主动脉瘤和夹层动脉瘤腔内治疗方法的一种较好选择,具有快速、简单、有效的优点;其远期疗效需进一步观察。     

Treatment of full-thickness skin defect with concomitant grafting of 6-fold extended mesh auto-skin and allogeneic cultured dermal substitute

The aim of this clinical study was to evaluate an allogeneic cultured dermal substitute (CDS) as a biological dressing for highly extended mesh auto-skin grafting. The subjects were five patients with extensive deep burn wounds. Allogeneic CDS was prepared by seeding fibroblasts on a spongy matrix of hyaluronic acid and atelo-collagen. Six-fold extended auto-skin graft was applied to the debrided wound, on which allogeneic CDS was placed. A conventional ointment-gauze dressing was used to protect the CDS. The CDS was applied repeatedly at intervals of 5-7 days. In all cases, the wounds were closed by successful take of mesh auto-skin graft and prompt epithelization from the grafted skin. The skin on the grafted area had a cicatrix appearance, but was soft and thin, maintaining good quality. The application of 6-fold extended auto-skin graft in conjunction with allogeneic CDS is an effective method for treatment of extensive severe burn wounds.     

皮肤软组织扩张术美容修复烧伤后头皮缺损合并颅骨外露

目的：探讨应用皮肤软组织扩张术一期修复头部深度烧伤所致头皮缺损和颅骨外露的可行性和实用性。方法：1998年～2008年,我科共收治14例严重烧伤后头皮缺损合并颅骨外露的患者,其中电击伤12例,煤气中毒昏迷后颞顶部煤炉灼伤2例。头皮缺损面积4cm×6cm～8cm×16cm,颅骨外露最小3cm×2cm,最大12cm×6cm。电击伤或深度烧伤后1～6月余,创面清洁换药后,无明显创周炎,术中碘伏纱布覆盖创面并缝合固定,应用圆形和肾形皮肤软组织扩张器,置于头皮帽状腱膜下层,其切口位于预扩张皮瓣的远端,剥离范围距离创缘不小于2cm。注水扩张时间为1～5月,扩张器埋置1～3只,注水扩张总容量300～900ml,扩张额外皮肤面积为缺损面积的1.5～2倍。术中将外露坏死颅骨外板予以清除;或者在颅骨外板上钻孔,等待肉芽生长后,再行预扩张皮瓣覆盖。将扩张器取出后,将皮瓣和腔隙内形成的纤维膜切断,以利于皮瓣延伸和转移,并放置负压引流。结果：扩张部位无1例发生感染;有2例预扩张面积不够,经头皮总动员覆盖头皮缺损创面;其中1例坏死颅骨清除不彻底,形成枕部窦道,经再次手术,清除死骨并行局部皮瓣转移手术,修复枕部窦道;1例颞骨外露创面经接力扩张修复。术后头皮毛发生长如常。结论：电击伤等所致头皮缺损合并颅骨外露创面,完全可以应用软组织扩张术形成的头皮预扩张皮瓣进行一次性美容修复,无须Ⅱ期解决秃发畸形问题,较传统方法有明显优点。