碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H2O2)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H2O2),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景：目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。 目的：观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。 材料：健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。 方法：用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。 结果：原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均> 0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。 结论：重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。     

慢病毒过表达Cdh1蛋白对星形胶质细胞反应性增殖作用的初步研究

目的探讨慢病毒过表达Cdh1蛋白对星形胶质细胞反应性增殖的影响。方法体外纯化培养大鼠星形胶质细胞:(1)随机分为Cdh1慢病毒组及空病毒组,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测Cdh1及Skp2蛋白表达的变化;(2)随机分为单纯氧糖剥夺/复氧组、Cdh1慢病毒干预组、空病毒干预组,氧糖剥夺1h复氧48h后,CCK-8法检测细胞增殖的变化。结果与空病毒组相比,Cdh1慢病毒组Cdh1蛋白表达总量增加,Skp2蛋白表达下降(P0.05);与单纯氧糖剥夺/复氧组相比,Cdh1慢病毒干预组细胞反应性增殖受到抑制(P0.05),空病毒组没有变化(P0.05)。结论慢病毒过表达Cdh1蛋白对氧糖剥夺再复氧后星形胶质细胞的反应性增殖有一定的抑制作用。     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞*☆

背景：胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常。神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体。 目的：拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达。 设计：细胞-基因学观察。 材料：新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。jetPEI转染试剂为PolyPlus 公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠。 方法：无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液。取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCl中制备JetPEI/DNA复合体。用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×108 L-1,向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL JetPEI/DNA复合体,置37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞。 主要观察指标：采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达。 结果：转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%。各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平最高。 结论：运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景：由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想，因此，应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度。 目的：观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。 方法：全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞，分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞，设定感染复数值为5×104，观察两组细胞形态改变，分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定，比较两组成骨活性差异。 结果与结论：人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后，细胞形态呈现典型的成骨改变，碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变。绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变。人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P < 0.01)。提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变。     

重组腺病毒p27kip1诱导脑胶质瘤细胞凋亡的初步研究

目的研究重组腺病毒介导的p27kip1体外对U251人胶质瘤细胞凋亡的影响。方法构建p27kip1重组腺病毒载体转染U251人胶质瘤细胞为实验组,并设正常对照组、空载体组,采用Western blot法检测相关蛋白的表达;采用Real time PCR法检测相关基因的表达;采用流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果 Western blot和Real time PCR结果均显示,实验组细胞经转染72h后,可见Bcl-2表达降低,同时Bax、Caspase3和Fas-L表达增强;流式细胞仪检测转染p27kip1腺病毒后能够抑制胶质瘤细胞的增殖。结论 p27kip1在体外能够抑制U251人胶质瘤细胞增殖,诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。     

腺病毒介导骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞

背景：已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族最具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少。 目的：探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2007-08/2008-06在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成。 材料：新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供。携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠。 方法：取兔颈后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞。取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪干细胞,并设立未转染对照组。 主要观察指标：细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后成骨活性。 结果：转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节;未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成。与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达。 结论：携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用。     

The indazole derivative YD-3 inhibits thrombin-induced vascular smooth muscle cell proliferation and attenuates intimal thickening after balloon injury

Proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is postulated to be one of the key events in the pathogenesis of atherosclerosis and restenosis. We investigated whether YD-3, a lowmolecular weight, non-peptide compound, could modulate proliferation of VSMCs in vitro and restenosis after balloon angioplasty in vivo. We examined the effect of YD-3 on thrombininduced VSMC proliferation by [(3)H]thymidine incorporation assay. The data demonstrated that YD-3 inhibited VSMC proliferation in a concentration-dependent manner. To define the mechanisms of YD-3 action, we found that YD-3 showed a profound inhibition on thrombin-induced Ras and ERK1/2 activities by using Western blotting analysis. Furthermore, oral administration of YD-3 exhibited a marked reduction in neointimal thickness using the carotid injury model in rats. Using immunochemical detection, our experiments also revealed that YD-3 significantly suppressed expression of the PAR-1 receptor, and markedly inhibited PAR-1-activating peptide (SFLLRN)-induced VSMC proliferation in a concentration-dependent manner. These results suggest that YD-3 inhibits thrombin-induced VSMC growth via the Ras- and ERK1/2-mediated signaling pathway. Moreover, YD-3 also shows a developmental potential in the treatment of atherosclerosis and restenosis after vascular injury.     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对血管损伤后新生内膜增生的影响*

背景：一氧化氮能够抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖,而一氧化氮合酶是其合成的关键酶,有关一氧化氮合酶基因体内转染对平滑肌细胞及动脉粥样硬化血管损伤后内膜增生影响少有报道。 目的：观察内皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因体内局部转染对动脉粥样硬化大鼠血管损伤后新生内膜增生的抑制作用。 方法：建立动脉粥样硬化Wistar大鼠颈动脉球囊损伤模型,建模后随机分成空白对照组、AdCMV-lacz对照组和AdCMV-eNOS组,分别将PBS,AdCMV-lacz和AdCMV-eNOS体内转染至以上3组大鼠的损伤血管壁。转染2周后培养并鉴定损伤局部平滑肌细胞,并用RT-PCR法检测各组损伤及转染后血管平滑肌细胞eNOS mRNA的表达,同时观察转染后不同时期新生内膜增生的影响。 结果与结论：AdCMV-eNOS组的颈总动脉血管平滑肌细胞可表达eNOS mRNA。3组大鼠转染后1和3个月,AdCMV-eNOS组内膜/中膜面积比值低于空白对照组和AdCMV-lacz对照组(P < 0.01)。结果显示,eNOS基因体内转染损伤后血管可以抑制血管新生内膜增生,减少再狭窄发生率。     

氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖及周期素D1的表达

背景：氧化型低密度脂蛋白可通过Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径诱导血管平滑肌细胞增殖及细胞周期蛋白的表达。 目的：观察胞外信号调节激酶是否参与了氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞周期推进以及周期素D1的表达。 设计、时间及地点：对照观察细胞学实验,于2008-02/10在广州医学院完成。 材料：人血浆低密度脂蛋白来自健康志愿者血清。SD大鼠由广州医学院实验动物中心提供。 方法：采用超速离心法分离人低密度脂蛋白进行氧化修饰及鉴定。以酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞,采用免疫组织化学染色法鉴定。 主要观察指标：在静止的血管平滑肌细胞中加入MEK1/2选择性抑制剂10 μmol/L PD98059和/或50 mg/L氧化型低密度脂蛋白,以CCK-8和细胞计数法测定细胞增殖,流式细胞术观察细胞周期,蛋白印迹检测周期素D1蛋白表达及胞外信号调节激酶的活性。 结果：CCK-8和细胞计数法显示,氧化型低密度脂蛋白能明显诱导血管平滑肌细胞增殖,PD98059抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖,并且呈时间依赖性。流式细胞术分析表明,经氧化型低密度脂蛋白处理24 h后,血管平滑肌细胞从G0/G1期进入S期,S期细胞百分比明显增高(P < 0.01),加入PD98059处理24 h后,血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期的推进受到抑制。蛋白印迹结果显示,氧化型低密度脂蛋白能明显诱导周期素D1蛋白表达及胞外信号调节激酶的磷酸化,PD98059抑制氧化型低密度脂蛋所诱导的周期素D1蛋白表达以及胞外信号调节激酶的磷酸化。 结论：氧化型低密度脂蛋白能诱导血管平滑肌细胞增殖,促进细胞由G0/G1期向S期转换以及周期素D1表达,其作用部分是由胞外信号调节激酶所介导。     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力*

背景：基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少。 目的：观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响。 方法：贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率。骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组。在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果与结论：重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%。缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05)。缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05)。提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关。     

人巨细胞病毒感染对人脑血管平滑肌细胞AT受体基因表达的影响

目的:探讨血管紧张素受体1、2(AT1,AT2)及人巨细胞病毒(HCMV)感染在动脉粥样硬化过程中的作用。方法:建立HCMV感染细胞模型,采用RT-PCR等技术研究在更昔洛韦(GCV)和AT1、AT2受体拮抗剂作用下,HCMV对体外培养人脑动脉血管平滑肌细胞AT1和AT2受体基因表达的影响。结果:HCMV感染体外培养的人脑血管平滑肌细胞上调了AT1和AT2受体的基因表达,AT1和AT2受体拮抗剂及GCV能够抑制HCMV感染对人脑血管平滑肌AT1和AT2受体的激活作用。结论:HCMV感染引起人脑血管平滑肌细胞增生可能由于AT1和AT2受体基因表达的激活。