用Fura-2测定单个巨噬细胞内游离钙的条件的优化

Fura- 2负载后用荧光显微镜成像系统研究单细胞内游离钙离子浓度 ( [Ca2 + ]i)应用已十分广泛 ,娄淑杰等 [1 ] 用此方法检测了 PC12细胞内的 [Ca2 + ]i,我们将娄淑杰等的方法应用于腹腔巨噬细胞 ( PEM) ,发现不尽理想 ,因此我们实验过程中对 Fura- 2的浓度进行了调整 ,另外 PEM作为参与炎症的非兴奋细胞 ,其活化对 [Ca2 + ]i有很大的影响 ,而细胞贴壁很可能导致活化 ,但测定方法又要求只能在贴壁细胞进行。因此 ,我们使用鼠尾胶缩短贴壁时间 ,并把检测用的 PEM的贴壁时间控制在一定范围之内 ,取得了比较理想的结果。1　材料和方法1.1…     

烫伤血清对大鼠库普弗细胞胞浆游离钙浓度的影响

目的:观察烫伤血清对大鼠分离培养的库普弗细胞(KC)胞浆内游离钙([Ca2+]i)浓度的影响.方法:胶原酶灌注消化、梯度离心分离KC,在KC悬液中加入烫伤血清,Fura-2/AM荧光染色法测定[Ca2+]i.结果:分离培养的KC静息状态下[Ca2+],为(109.29±4.17)nmol/L,烫伤血清可以使[Ca2+]i显著升高,以烫伤后6 h的血清作用最明显;[Ca2+]i的浓度随血清浓度的升高而升高;烫伤血清作用1 min KC[Ca 2+]i已明显升高,2 min达高峰,20 min时仍明显高于假烫组.结论:烫伤血清能明显升高KC[Ca2+]i,作用快速而持久,且呈浓度依赖性.     

PDGF-BB对肾小球系膜细胞[Ca2+]i和细胞增殖的影响

目的研究肾小球系膜细胞[Ca2+]i的变化与系膜细胞增殖之间的关系. 方法以体外培养的系膜细胞为研究对象,激光共聚焦显微术结合Fura-3染色法,动态测定细胞[Ca2+]i,MTT法测定细胞增殖. 结果血小板衍生生长因子(PDGF)-BB可浓度依赖性地引起肾小球系膜细胞[Ca2+]i的升高,并促进细胞增殖.钙通道阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂均可同时抑制PDGF-BB引起的细胞钙浓度升高和细胞增殖.中药成分雷公藤多甙在显著抑制系膜细胞增殖的同时,对细胞游离钙却无影响. 结论肾小球系膜细胞[Ca2+]i的升高和细胞增殖之间存在着正性关联,但[Ca2+]i的升高并非细胞增殖的唯一途径.     

神经生长因子对小鼠海马突触体内[Ca2+]i的影响

目的探讨神经生长因子(NGF)对小鼠海马突触体内[Ca2+]i水平的影响.方法采用海马内微注射方法,使用荧光指示剂Fura-2/AM检测各组小鼠海马突触体内[Ca2+]i水平.结果1.NGF对青年小鼠海马突触体内[Ca2+]i水平没有显著影响;2.NGF能缓解衰老小鼠海马突触体内[Ca2+]i超载现象;3.NGF也能降底人为海马突触体内[Ca2+];水平.结论NGF通过调节海马突触体内[Ca2+]i的水平来改善衰老动物的学习记忆能力.     

人参皂甙Rg1对缺氧豚鼠心肌细胞游离钙浓度降低作用的研究

目的探讨人参皂甙(ginsentosides,Gin)单体Rgl及维拉帕米(verapamil,Ver)对豚鼠心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)变化的影响.方法采用离体豚鼠心脏Langendorff法灌注,胶原酶Ⅰ型分离心肌细胞,用荧光指示剂方法(Fura-2/AM)标记心肌([Ca2+]i)变化.将心肌细胞悬液分为3组对照组、Rgl组和Ver组.观察缺氧后心肌[Ca2+]i的变化.结果(1)正常氧状态心肌[Ca2+]i均值为(125.4±10.3)nmol/L(n=20).(2)缺氧状态下,心肌[Ca2+]i增加与缺氧时间(程度)直线相关,相关系数r为0.98左右.(3)Rgl对缺氧后心肌[Ca2+]i增加明显延缓.结论Rgl在缺氧条件下,使心肌[Ca2+]i明显下降,从而阻止心肌细胞内钙超载,其作用与Ver相似,我们认为Rgl具有心肌细胞的保护作用.     

烧伤血清对大鼠腹腔巨噬细胞内游离钙浓度及其产生NO的影响

目的:观察烧伤血清对分离的大鼠腹腔巨噬细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)和产生NO的影响.方法:收集腹腔巨噬细胞,用Fura-2/AM作为细胞内游离钙离子指示剂测定[Ca2+]i,用烧伤血清刺激体外的腹腔巨噬细胞即刻进行[Ca2+]i的测定;用同浓度的烧伤血清刺激培养的腹腔巨噬细胞,测定上清NO稳定的代谢产物[NO2+NO3-]的浓度.结果:烧伤血清能显著地促进巨噬细胞[Ca2+]i的增高,以烧伤后6 h血清的作用最为明显,可达正常对照组的9倍,维拉帕米可部分抑制其作用.烧伤血清对腹腔巨噬细胞NO的产生有明显的抑制作用,也以6 h烧伤血清为最明显.结论:烧伤血清能显著地升高腹腔巨噬细胞[Ca2+]i,而NO的产生被明显地抑制.细胞内钙超载和NO产生减少可能是烧伤后早期巨噬细胞免疫功能损伤主要因素之一.     

AngⅡ对大鼠肝脏星状细胞内 [Ca2+]i及其增殖的影响

目的观察不同浓度血管紧张奏Ⅱ(Ang Ⅱ)对大鼠肝脏星状细胞(HSC) [Ca2+]i及其增殖的影响,以探讨HSC和细胞内 [Ca2+]i的相关性. 方法HSC分离培养后,采有MTT法和Fura-2/AM荧光指示剂负载分别测定HSC增殖情况及细胞内 [Ca2+]i. 结果10-9 ～10-5mol/L Ang Ⅱ能显著增加HSC内游离 [Ca2+]i(P＜ 0.01),且呈剂量依赖关系;10-9 ～10-6mol/L Ang Ⅱ均能促进HSC增殖(P＜0.05),但10-5mol/L Ang Ⅱ却对HSC增殖无显著影响(P＞0.05). 结论在一定剂量范围内Ang Ⅱ能够剂量依赖性地促进HSC增殖和增加HSC内游离 [Ca2+]i,二者存在一定相关性.     

弓形虫速殖子细胞质游离钙浓度的测定

目的研究弓形虫与宿主细胞之间相互作用的钙通道机制.方法以急性期感染小鼠腹水收集的RH株刚地弓形虫速殖子为材料,采用荧光染料Fura-2与细胞质游离钙结合,通过荧光分光光度计技术和Super Ion Probe Software计算机软件测定弓形虫速殖子细胞质游离钙浓度([Ca2+]i).结果正常弓形虫速殖子[Ca2+]i为(205.02±18.6)nmol/L,符合文献报道的静息状态下真核细胞[Ca2+]i浓度范围.结论本方法简便、易行,相对费用低,适用于国内实验室.     

神经生长因子对小鼠海马突触体内[Ca2+]i的影响

目的探讨神经生长因子(NGF)对小鼠海马突触体内[Ca2+]i水平的影响。方法采用海马内微注射方法,使用荧光指示剂Fura-2／AM检测各组小鼠海马突触体内[Ca2+]i水平。结果1．NGF对青年小鼠海马突触体内[Ca2+]i水平没有显著影响;2．NGF能缓解衰老小鼠海马突触体内[Ca2+]i超载现象;3．NGF也能降底人为海马突触体内[Ca2+];水平。结论NGF通过调节海马突触体内[Ca2+]i的水平来改善衰老动物的学习记忆能力。     

LTD4诱导大鼠气道平滑肌细胞收缩的机制

目的探讨LTD4对气道平滑肌细胞(ASMC)收缩的机制.方法以Fluo-3/AM作为细胞内游离Ca2+示踪剂,通过激光共聚焦显微镜观察LTD4对原代大鼠ASMC细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)及细胞收缩的影响;观察胞外Ca2+、G蛋白、蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白(MAPK)在LTD4生理效应中的作用. 结果LTD4刺激后,[Ca2+]i上升前有一个潜伏期,随后缓慢增加.随着LTD4浓度上升,潜伏期逐渐缩短(P＜0.05).在无钙溶液中,LTD4诱导的[Ca2+]i上升明显抑制(P＜0.01).随LTD4浓度上升,ASMC收缩程度也有增强趋势(P＞0.05).LTD4诱导的[Ca2+]i上升与细胞收缩程度显著相关(P＜0.01).PTX对LTD4诱导ASMC[Ca2+]i上升和收缩均有明显抑制作用.Staurosporine对[Ca2+]i上升无明显影响,但对收缩有明显抑制作用.PD098059对[Ca2+]i上升无明显影响,对收缩有部分抑制.结论在大鼠ASMC中,LTD4诱导[Ca2+]i缓慢上升,并有潜伏期.[Ca2+]i在LTD4诱导ASMC收缩中起关键作用.G蛋白、PKC、MAPK在LTD4生理效应中起重要作用.     

硝苯地平和SK&F96365对环匹阿尼酸引起的平滑肌细胞质游离Ca2+ 浓度升高作用的影响

目的探讨介导Ca2+池操纵性Ca2+内流的Ca2+通道特性. 方法以Fura-2荧光探针测定细胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]i). 结果 (1)10 μmol/L环匹阿尼酸(CPA)可触发大鼠主动脉平滑肌细胞[Ca2+]i的双相升高(峰值和持续相).(2)SK&F96365(5～40 μmol/L)以浓度依赖性抑制CPA触发的[Ca2+]i升高持续相.(3)1 μmol/L硝苯地平阻断电压依赖性Ca2+通道后,20 μmol/L SK&F96365仍能抑制CPA触发的[Ca2+]i升高持续相;而在20 μmol/L SK&F96365抑制CPA触发[Ca2+]i升高持续相后,1 μmol/L硝苯地平不能产生进一步的抑制作用. 结论电压依赖性Ca2+通道和Ca2+池操纵性Ca2+通道介导了Ca2+池操纵性Ca2+内流.     

GPR40反义RNA对胰岛β细胞内Ca2+浓度及胰岛素分泌的影响

目的应用反义RNA技术特异性下调胰岛β细胞G蛋白耦联受体(GPR40)的表达,观察其对胰岛β细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)及胰岛素分泌的影响。方法体外分离SD大鼠胰岛β细胞,将GPR40反义RNA表达载体pcDNA3.1(+)-GPR40(-)用脂质体体外瞬时转染胰岛细胞,Western blot检测GPR40蛋白的表达,将1.0 mmol/L游离脂肪酸(软脂酸∶油酸=2∶1)与胰岛细胞共培养10,30,60 min,进行高葡萄糖刺激胰岛素释放试验,利用荧光探针Fura-2/AM,测定胰岛细胞[Ca2+]i变化,放射免疫法检测培养液中胰岛素浓度变化。结果与对照组和空白质粒转染组比较,GPR40反义RNA可显著降低细胞GPR40蛋白的表达水平(P<0.05),在各作用时间点,GPR40反义RNA转染组[Ca2+]i显著低于对照组(P<0.05),同时GPR40反义RNA转染组胰岛细胞的胰岛素分泌明显低于对照组(P<0.05)。结论 GPR40介导游离脂肪酸刺激β细胞内[Ca2+]i升高和胰岛素分泌。     

高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素对体外培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响.方法 采用荧光探针技术,应用激光共聚焦显微镜动态、定量测定细胞外高钙、钙拮抗剂条件下,正常、高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖+高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的变化.结果 高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖+高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高,在细胞外高钙条件下各组[Ca2+]i均降低,在细胞外钙拮抗剂条件下各组[Ca2+]i均再次下降.结论 高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素均能使视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高,而钙拮抗剂通过干扰细胞外钙离子进入细胞来降低[Ca2+]i.     

NGF和CgA对RWPE-1细胞内钙离子浓度变化的影响及其在慢性前列腺炎中的作用

目的 探讨神经生长因子(NGF)和嗜铬颗粒蛋白A(CgA)处理后前列腺上皮细胞系RWPE-1细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的差异及NGF和CgA在慢性前列腺炎(CP)发病中的作用.方法 不同浓度的NGF和CgA(50、200 ng/ml)刺激RWPE-1细胞,用激光共聚焦显微镜观察不同浓度的NGF和CgA刺激后细胞内[Ca2+]i变化,加入TRPV1受体拮抗剂后继续观察细胞内[Ca2+]i变化.然后,将正常细胞外液换成D-PBS,再加入NGF和CgA观察细胞内[Ca2+]i变化.结果 50 ng/ml NGF和CgA刺激细胞后,细胞内[Ca2+]i未见明显变化.200 ng/ml NGF和CgA刺激细胞后,细胞内[Ca2+]i明显增加,加入TRPV1受体拮抗剂后,细胞内[Ca2+]i未见明显变化.将正常细胞外液换成D-PBS,用NGF和CgA刺激后,细胞内[Ca2+]i未见明显改变.结论CP的发生可能是通过分泌和释放NGF和CgA,引起前列腺上皮细胞膜TRPV1通道开放,促使细胞内钙离子浓度增加,导致前列腺上皮分泌功能下降所致.     

LTD4诱导大鼠气道平滑肌细胞收缩的机制

目的探讨LTD4对气道平滑肌细胞（ASMC）收缩的机制。方法 以Fluo-3/AM作为细胞内游离Ca2+示踪剂,通过激光共聚焦显微镜观察LTD4对原代大鼠ASMC细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）及细胞收缩的影响;观察胞外Ca2+、G蛋白。蛋白激酶C（PKC）、丝裂素活化蛋白（MAPK）在LTD4生理效应中的作用。结果　LTD4刺激后,[Ca2+]i上升前有一个潜伏期,随后缓慢增加。随着LTD4浓度上升,潜伏期逐渐缩短（P<0.05）。在无钙溶液中,LTDA诱导的[Ca2+]i上升明显抑制（P<0.01）。随LTD4浓度上升,ASMC收缩程度也有增强趋势（P>0.05）。LTD4诱导的[Ca2+]i上升与细胞收缩程度显著相关（P<0.01）。PTX对LTD4诱导ASMC[Ca2+]i上升和收缩均有明显抑制作用。Staurosporine对[Ca2+]i上升无明显影响,但对收缩有明显抑制作用。PD098059对[Ca2+]i上升元明显影响,对收缩有部分抑制。结论 在大鼠ASMC中,LTD4诱导[Ca2+]i缓慢上升,并有潜伏期。[Ca2+]i在LTD4诱导ASMC收缩中起关键作用。G蛋白、PKC、MAPK在LTD4生理效应中起重要作用。     

酸枣仁汤含药血清对皮质酮损伤的PCI2细胞[Ca2+]i、CaM的影响

目的:观察酸枣仁汤含药血清对皮质酮损伤的PC12细胞[Ca2+]i、CaM的影响.方法:以高浓度皮质酮诱导PC12细胞凋亡模拟焦虑症神经细胞损伤状态.通过激光共聚焦显微镜法检测[Ca2+]i浓度、细胞化学染色法测定CaM的表达,探讨酸枣仁汤含药血清对皮质酮诱导PC12细胞凋亡的钙信号转导通路的影响.结果:与空白对照组比较,皮质酮组细胞内[Ca2+]i浓度显著升高;与皮质酮+正常动物血清组比较,皮质酮+酸枣仁汤含药血清组细胞内[Ca2+i浓度显著降低,皮质酮+安定含药血清组'皮质酮+酸枣仁汤含药血清组细胞CaM表达明显下降.结论:胞内钙超载可能是皮质酮诱导PC12细胞凋亡的主要原因之一,酸枣仁汤含药血清可能通过减轻胞内钙超载,减少Ca2+-CaM复合物的产生,拮抗皮质酮诱导的PC12细胞凋亡.     

益气温阳活血方对慢性心衰大鼠心室重构钙调磷酸神经酶信号通路的影响研究

目的 探讨中药复方益气温阳活血方对慢性心衰大鼠心室重构钙调磷酸神经酶(CaN)信号通路的影响.方法 体内、外试验应用Fura-2/AM比率荧光成像系统检测心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i);以RT-PCR法以及Western-blot法检测CaN、活化T细胞核因子3(NFAT3)mRNA及蛋白质表达水平在益气温阳活血方及拆方治疗前后的变化.结果 与正常组比较,模型组[Ca2+] i、心肌组织及心肌细胞CaN、NFAT3mRNA及蛋白质的表达水平均明显明显升高;益气温阳活血方能够明显减少[Ca2+] i、抑制CaN、NFAT3 mR-NA及蛋白质表达水平的升高.结论 CaN信号通路在慢性心衰心室重构机制中起重要作用;益气温阳活血方可能通过抑制CaN信号通路改善心室重构.     

三氧化二砷对人肺腺癌Anip973细胞内[Ca2+]i的影响

目的研究三氧化二砷(As2O3)对人肺腺癌Anip973细胞内游离[Ca2+]i的影响.方法培养人肺腺癌Anip973细胞,用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察As2O3对人肺腺癌Anip973细胞内游离[Ca2+]i的影响;用生长曲线法测药物对肿瘤细胞增殖的影响.结果①LSCM显示As2O3 作用后的人肺腺癌细胞Anip973细胞内[Ca2+]i显著升高(P<0.001).②As2O3 对人肺腺癌细胞株Anip973细胞内[Ca2+]i升高作用具有剂量依赖性.③As2O3 能明显抑制人肺腺癌Anip973细胞的增殖.结论 As2O3 可能是通过升高人肺腺癌细胞内[Ca2+]i 来启动细胞凋亡机制,诱导肺癌细胞凋亡,从而抑制其增殖.     

酸枣仁汤含药血清对皮质酮损伤的PC12细胞[Ca~(2+)]i、CaM的影响

目的:观察酸枣仁汤含药血清对皮质酮损伤的PC12细胞[Ca2+]i、CaM的影响。方法:以高浓度皮质酮诱导PC12细胞凋亡模拟焦虑症神经细胞损伤状态,通过激光共聚焦显微镜法检测[Ca2+]i浓度、细胞化学染色法测定CaM的表达,探讨酸枣仁汤含药血清对皮质酮诱导PC12细胞凋亡的钙信号转导通路的影响。结果:与空白对照组比较,皮质酮组细胞内[Ca2+]i浓度显著升高;与皮质酮+正常动物血清组比较,皮质酮+酸枣仁汤含药血清组细胞内[Ca2+]i浓度显著降低,皮质酮+安定含药血清组、皮质酮+酸枣仁汤含药血清组细胞CaM表达明显下降。结论:胞内钙超载可能是皮质酮诱导PC12细胞凋亡的主要原因之一,酸枣仁汤含药血清可能通过减轻胞内钙超载,减少Ca2+-CaM复合物的产生,拮抗皮质酮诱导的PC12细胞凋亡。     

应用Fura-2/AM荧光双波长法研究抑肽酶对血小板活化的保护作用

目的探讨抑肽酶对血小板活化的保护机制.方法用钙荧光指示剂Fura-2/AM负载人洗涤血小板,用荧光双波长分光光度计比值法测定静息血小板胞浆游离钙浓度([Ca2 ]i)及凝血酶、抑肽酶对[Ca2 ]i的影响.结果在生理胞外Ca2 浓度时,正常人血小板[Ca2 ]i静息水平为(151.840±28.719)nmol/L,凝血酶可引起血小板[Ca2 ]i的明显增加(P＜0.01),抑肽酶呈剂量依赖性地抑制由凝血酶引起的[Ca2 ]i的增加(P＜0.01).结论抑肽酶的保护血小板机制与其抑制血小板内[Ca2 ]i动员等信息传递过程有关.