酵母三杂交系统研究进展

许多生物过程是通过大分子如蛋白-蛋白，核酸-蛋白的相互作用来实现的，对这些大分子间的相互作用的研究有助于揭示生命过程的分子作用机制。酵母双杂交系统是研究蛋白间相互作用的有用工具，随着该系统的广泛应用，在此基础上发展了三杂交系统，研究包括三种成分在内的更为复杂的大分子相互作用，为蛋白-蛋白、RNA-蛋白和小分子-蛋白相互作用的研究提供了新的手段。     

酵母双杂交RRS筛选系统对已知蛋白间相互作用的验证

目的:通过一对已知蛋白Pak和Chp间的相互作用介绍酵母双杂交RRS筛选系统,以期将此系统更广泛的用于蛋白间相互作用的研究.方法:挑选酵母温度缺陷株cdc25-2的低回复突变单克隆,醋酸锂法制备酵母感受态细胞.重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak 单独转化酵母,排除诱饵蛋白的白激活作用.将两重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak和Ura-M-ChpAc共转化酵母,设置不同质粒组合和不同培养基平板作为对照,观察酵母在36℃的生长情况.结果:制备感受态的cdc25-2细胞无回复突变发生.质粒Met425-Myc-Ras-Pak转化酵母后对细胞既无毒性也无自激活作用.只有当能够表达两已知蛋白的重组质粒共转化酵母,并且在适合它们表达的培养基上,cdc25-2细胞才能够在36℃生长.结论:(1)RRS筛选系统正确验证了Pak和Chp间的相互作用,可将其用于其它已知蛋白间相互作用的研究.(2)可以利用某已知蛋白构建诱饵,通过RRS筛选系统去寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白.     

酵母双杂交技术及其在分子生物学中的应用

研究生物大分子之间相互作用,是生物科学领域中经常遇到的重要课题。为此通常应用一些生物化学技术,诸如免疫共沉淀、交链技术、层析中共分部分离等。自从Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast tow-hybrid system),这一研究蛋白质间相互作用的新技术已经得到了广泛的应用。它的可行性、有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的候选蛋白的研究中已被证实并被推广到了诸如细胞周期调控、信号转导、肿瘤基因表达等多个研究领域,受到了越来越多的重视。     

聚环氧乙烷／脂肪族聚碳酸酯共混研究

本文用差热分析(DSC)和红外光谱仪(FTIR)研究了聚环氧乙烷(PEO)和新型聚合物——脂肪族聚碳酸脂(PPC)共混热行为和大分子间的相互作用。由熔点下降方法给出PEO/PPC混合体系在320K下相互作用参数为-0.46;FTIR谱表明PPC大分子链和PEO大分子链存在较强的相互作用;PEO/PPC共混形态随PPC含量增加发生了较大变化。     

自噬对先天性免疫的调控

自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡方式,是运输细胞质成分进入溶酶体的蛋白降解系统[1-2].主要清除细胞内受损细胞结构、衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子等,自噬机制失灵将导致细胞异常甚至死亡[3].通过对酵母遗传学筛选的研究,已发现一些关键的自噬分子,即自噬相关蛋白(Atgs)[1-2].在Atgs和其他蛋白作用下可促进自噬清除病原体,从而保护机体免受损害.但某些细菌,如福氏志贺菌[4],感染后可通过干扰或阻止自噬溶酶体形成等来调控或阻碍自噬,以利于自身存活.可见,自噬在先天性免疫、特别是模式识别受体与病原体成分相互作用过程调控中起重要作用.     

PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的 筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域.方法 采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用.结果 酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1 (WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用.结论 RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位.     

神经末梢突触囊泡相关的调节蛋白

神经末梢突触囊泡释放神经递质是一个受到精细调控的过程,涉及多种蛋白质间的网络状相互作用,包括蛋白复合物的组装和构象调节、突触囊泡的定向性运输、囊泡入坞、膜融合、递质释放以及囊泡膜和蛋白的重摄取等,这一大循环里的每一步都离不开各种相关蛋白的相互作用.该文围绕这些调控蛋白的分子结构、生理功能以及蛋白间的相互作用作一综述.     

Snapin蛋白研究进展

细胞的分泌功能是一个涉及许多蛋白质、脂质分子等物质并有多个细胞器参与的复杂过程,通过囊泡胞吐过程来完成,真核细胞内生物大分子的分泌通过组成型和调节性囊泡运输两种方式进行,其中组成型囊泡运输涉及了一系列细胞器与细胞膜之间的囊泡融合,囊泡与细胞膜的融合涉及到了几个蛋白家族包括:SNAREs,Rab蛋白和Sec1/Munc-18相关蛋白等.SNARE(可溶性N-乙基-马来酰胺敏感因子结合蛋白受体)蛋白是介导囊泡与细胞膜或其他细胞器融合的主要蛋白分子, 参与囊泡内蛋白质与膜转运、调节性和非调节性囊泡胞吐活动的激活和融合过程.囊泡融合是通过几种辅助蛋白与SNAREs相互作用完成的,Snapin就是SNAREs的辅助蛋白之一.     

Abl相互作用蛋白-1在肿瘤基础与临床研究中的进展

ABl相互作用蛋白-1(Abl interactor protein 1,Abi1)作为接合蛋白参与肌动蛋白重建,在细胞的多种生物学行为中发挥重要的作用;通过形成不同的大分子复合物,调控着多种与肿瘤细胞增殖、凋亡、黏附、迁移等相关的信号传导通路;并与某些类型的白血病及部分恶性实体肿瘤的发生发展密切相关.Abi1作为潜在的分子靶点在肿瘤的基础和临床研究中显示出广阔的研究前景.     

Gβ，Gβγ与腺苷酸环化酶Ⅱ在酵母双杂交和三杂交系统中的相互作用

目的 探讨G蛋白β和γ亚基在Gβγ与效应器相互作用中的地位,特别是γ亚基在此相互关系中的作用。方法 利用酵母双杂交和自行构建的酵母三杂系统分别研究Gβ1和Gβγ2与腺苷酸环化酶Ⅱ（ACⅡ）的相互作用。结果 发现酵母三杂交系统中AD－β、γ2和BD－ACⅡ间的朴素作用明显强于双杂交系统中AD－β、和BD－ACⅡ的相互作用。对BD－ACⅡQ和AD－β、在酵母双杂交系统和三杂交系统中的表达进行免疫印迹杂交分析,发现其表达水平与β、兰乳糖苷酶活力大小无关,即酵母三杂交系统和双杂交系统中相互作用的显著差别不是由BD－ACⅡQ和AB－β1蛋白表达水平的差异所造成。结论 β亚基对维持Gβγ与ACⅡ的相互作用十分重要,而γ亚基的存在显著增强了β亚基与ACⅡ的相互作用,对维持Gβγ与ACⅡ的高亲和性很重要。     

单颗粒冷冻电镜揭开G蛋白偶联受体结构生物学研究的新篇章

G蛋白偶联受体（GPCR）是生物体内一类庞大而又多样的细胞膜蛋白。GPCR可以应细胞外信号发生构象变化,进而结合不同效应蛋白激活下游多种信号转导通路,调控众多生命活动过程,参与几乎所有病理过程的发生和发展。近年来,冷冻电镜技术在研究生物大分子结构方面取得了突飞猛进的发展,基于冷冻电镜的GPCR信号转导复合物的高分辨率三维结构不断出现。本文阐述了GPCR和G蛋白复合物相互作用的共性结构特征——受体第六个跨膜螺旋的构象变化,也展示了GPCR识别不同G蛋白亚型选择性的结构基础。单颗粒冷冻电镜提供了更加高效地鉴定受体与配体相互作用分子机制的方法,为GPCR信号通路的机制研究以及基于结构的药物理性设计提供了重要信息。     

共振能量转移(RET)技术的发展及应用

蛋白质间的相互作用是生命活动的基本形式之一,这种作用对细胞内信号转导,基因的转录激活等有重要意义.传统的检测方法存在损伤细胞结构、不能实时动态观察蛋白相互作用的缺点.RET技术的发展,解决了上述问题,为我们更好的研究蛋白质相互作用提供了强有力的工具.本文从FRET和BRET的基本原理、新型RET技术的发展等方面进行介绍,并将FRET和BRET进行比较,以便更好的选择研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法.     

水溶液中不同氨基酸与甲醇分子间的异系焓相互作用

目的 探讨氨基酸-甲醇-水三元体系中溶质分子间相互作用机制，为揭示蛋白质的稳定机制、蛋白质变性的原因和生物大分子与小分子间的相互作用提供溶液热力学依据。方法利用2277热活性检测仪的流动测量系统测定298．15K时甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸分别与甲醇在水溶液中的混合过程的热功率和稀释热功率，依据McMillan-Mayer理论进行多元线性回归分析。结果得到氨基酸和甲醇相互作用的混合焓以及各自的稀释焓和异系焓相互作用系数。利用k值讨论了不同氨基酸与甲醇分子的作用机制。结论不同氨基酸与甲醇分子间的焓作用系数的大小主要取决于氨基酸分子结构的差异，氨基酸的非极性侧基对焓作用系数有正贡献；脯氨酸特殊的五元吡咯环结构也表现出疏水性，对hxy值有较大的正贡献。     

14-3-3/HIP-55复合体增强HIP-55蛋白稳定性

目的:用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术验证HIP-55与14-3-3在HEK293细胞中存在相互作用,并进一步研究其生物学意义. 方法:利用GATEWAY系统构建PDEST-N-Venus-HIP-55WT(野生型),PDEST-N-Venus-HIP-55AA(突变体S269A/T291A),PDEST-GST-HIP-55WT及PDEST-C-Venus-14-3-3τ重组质粒,利用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术检测两者的相互作用,同时应用14-3-3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突变体( HIP-55AA突变体S269A/T291A不能与14-3-3相互作用)作为工具研究两者结合后对嘌呤霉素诱导的HIP-55蛋白表达的影响. 结果:外源转入的Venus-HIP-55WT、Venus-HIP-55AA及Venus-14-3-3蛋白能够在HEK293细胞中表达;双分子荧光互补实验结果表明HIP-55与14-3-3存在相互作用,HIP-55蛋白的S269/T291位点介导HIP-55与14-3-3的相互作用;免疫共沉淀技术表明内源性HIP-55与14-3-3存在相互作用;进一步研究发现HIP-55与14-3-3复合体增强HIP-55蛋白的稳定性,保护HIP-55不被降解. 结论:14-3-3与HIP-55存在相互作用,14-3-3/HIP-55复合体可以促进HIP-55蛋白的稳定性.     

凋亡抑制蛋白14-3-3ζ与肿瘤的关系

凋亡抑制蛋白14-3-3ζ蛋白主要以同源/异源二聚体形式存在,是真核生物中广泛表达的酸性蛋白。14-3-3ζ蛋白通过募集配体分子参与调节细胞周期、有丝分裂、凋亡和侵袭等多个细胞过程。多项研究表明,14-3-3ζ蛋白在多种恶性肿瘤的发生、发展和耐药中发挥重要作用;14-3-3ζ蛋白是通过调节靶蛋白间的相互作用在肿瘤细胞多条信号转导通路中发挥调控作用的;14-3-3ζ蛋白与肿瘤的发生和治疗密切相关。     

液-液相分离在基因转录调控中功能机制的研究进展Research progress in functional mechanism of liquid-liquid phase separation in gene transcription regulation

基因表达的转录是指在RNA聚合酶的催化下，以单链DNA为模板，合成mRNA的过程，这一过程需要多种不同蛋白大分子相互协调，在基因组DNA位点上组装成大型稳定的蛋白复合物，通过转录调节在基因表达中发挥核心作用。转录蛋白分子复合物可以通过多价相互作用，形成液-液相分离聚集，定位于细胞核中特异的基因位点处，参与基因转录的调控。目前液-液相分离在转录调控过程中的功能机制尚不完全清楚，现从基因转录抑制、转录激活、转录延伸和剪接等方面阐述液相分离在基因转录过程中的研究进展，总结其对基因表达调控的研究成果，为生物分子液-液相分离在基因转录中的进一步研究提供依据。     

锌指蛋白与大肠癌

几乎所有的生物过程都涉及生物大分子之间特异的相互作用.这些作用有赖于大分子内的特殊结构域,锌指即为一种重要的能与DNA结合的结构域.     

血管紧张素Ⅱ受体与降钙素基因相关肽受体间相互调节在心血管疾病中的意义

血管紧张素Ⅱ受体(ANGⅡR)和降钙素基因相关肽受体(CGRPR)同属于G蛋白藕联受体家族.研究发现,单独激活ANGⅡR或CGRPR和同时激活两受体对细胞的命运表现出不同甚至相反的作用.目前已知,CGRP受体是由降钙素受体样受体(CRLR)、受体活性修饰蛋白-1(RAMP1)、受体组分蛋白(RCP)3个组分组成.ANGⅡR和CGRPR间的相互作用可能发生在细胞膜的信号转导、细胞浆信号通路以及核内的基因转录等水平.本文综述了ANGⅡR和CGRPR在跨膜信号蛋白(如G蛋白及caveolae/caveoilins)、胞浆-胞核内信号蛋白(如NADPH氧化酶、MAPK家族)水平的相互作用,可望从心血管受体间信号整合改变的新视角来解释心血管疾病的发病机制.     

阳离子单体DAC及其聚合物与牛血清白蛋白之间的相互作用

以紫外吸收光谱和荧光发射光谱为手段,研究了阳离子单体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（DAC）与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用。采用表面引发接枝聚合法制备了接枝微粒SiO2-g-PDAC,探索研究了接枝大分子PDAC与BSA之间的相互作用及作用机理。 研究结果表明：在水溶液中,单体DAC与BSA之间可产生强静电相互作用,凭借此强次价键力,单体DAC与BSA可形成主-客体复合物,且在中性溶液中,单体DAC与BSA之间的静电相互作用最强。 接枝大分子PDAC与BSA之间也具有强静电相互作用,接枝微粒SiO2-g-PDAC对BSA可产生强吸附作用。当介质的pH在BSA的等电点(4.7) 附近时,接枝微粒对BSA的吸附容量最大;升高温度不利于主- 客体之间的静电相互作用,接枝微粒对BSA的吸附容量随温度升高而降低。     

与登革病毒NS4A蛋白相互作用的宿主蛋白的鉴定

目的 鉴定与登革病毒NS4A蛋白发生相互作用的宿主蛋白.方法 利用串联亲和纯化系统(TAP)纯化分离与NS4A相互作用的蛋白,进行质谱分析,鉴定可能与NS4A相互作用的蛋白;构建其真核表达质粒,通过蛋白免疫共沉淀技术验证其相互作用.结果 质谱结果表明α磷酸烯醇酶(Eno-1)可能与登革病毒的NS4A存在相互作用,在pSG5载体中构建了C端带FLAG标签的pSG5-Eno-1-FLAG重组质粒,并检测到其真核表达.共表达pSG5-Eno-1-FLAG和pSG5-NS4A-HA重组质粒,双向蛋白免疫共沉淀实验进一步证实了Eno-1是与NS4A相互作用的宿主蛋白.结论 宿主蛋白Eno-1与登革病毒NS4A存在相互作用,为进一步阐明NS4A在登革病毒复制过程中的调控机制奠定了基础.