自杀基因治疗中间隙连接的作用

自杀基因治疗肿瘤中，旁观者效应有非常重要的作用，本文即总结了近年来研究细胞间通过间隙连接的信息交流（ＧＩＣ）在旁观者效应中的作用的文献。     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因系统体内外旁观者效应的观察

目的　观察腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统的体外、体内接触及体内远端旁观者效应。　方法　采用向体外培养的tk阴性人肝癌BEL 74 0 2细胞中加入不同比例tk阳性同种细胞 ;向荷tk阴性BEL 74 0 2瘤小鼠瘤体内注射不同数量tk阳性同种细胞 ;向双侧荷瘤小鼠一侧瘤体内注射重组腺病毒 ,GCV作用后用不同方法来观察不同情况下的旁观者效应。　结果　体外组中观察到明显旁观者效应 ,当tk阳性细胞占 10 %时 ,混合细胞存活率为 36 6 % ;体内接触组中也观察到旁观者效应 ,实验组瘤体生长明显受到抑制 (P <0 0 5 ) ;体内远端组中 ,未观察到旁观者效应 (P >0 0 5 )。结论　腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统在体外及体内接触时均存在旁观者效应     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统体内外旁观者效应的观察

目的：观察腺病毒介导的HSV－tk/GCV自杀基因系统的体外,体内接触及体内远端旁观者效应。方法：采用向体外培养的tk阴性人肝部BEL－7402细胞中加入不同比例tk阳性同种细胞;向荷tk阴性BEL－7402小鼠瘤体内注射不同数量tk阳性同种细胞;向双侧荷瘤小鼠一侧瘤体内注射重组腺病毒,GCV作用后用不同方法来观察不同情况下的旁观者效应。结果：体外组中观察到明显旁观者效应,当tk阳性细胞占10％时,混合细胞存活率为36．6％,体内接触组中也观察到旁观者效应,实验组瘤体生长明显受到抑制（P＜0．05）;体内远端组中,未观察到旁观者效应（P＞0．05）。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV自杀基因系统在体外及体内接触时均存在旁观者效应。     

自杀基因治疗中间隙连接的作用(文献综述)

自杀基因治疗肿瘤中,旁观者效应有非常重要的作用,本文即总结了近年来研究细胞间通过间隙连接的信息交流（GIC）在旁观者效应中的作用的文献。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染人PA317细胞，用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC-SD，G418筛选出阳性细胞(GBC-SD/CD tk，应用不同浓度的5-FC或(和)GCV，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的GBC-SD/CD tk和GBC-SD细胞混合，联合应用5FC和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5FC或GCV均能对转染阳性的GBC-SD／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

全反式维甲酸增强单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对前列腺癌PC-3细胞旁观者效应的研究

目的观察全反式维甲酸（ATRA）对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因结合更昔洛韦（HSV-tk／GCV）旁观者效应的增强作用及与Cx43表达的关系。方法用携带HSV-tk基因的腺病毒液感染人前列腺癌PC-3细胞，半定量逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测HSV-tk基因整合情况，噻唑蓝（MTr）方法观察ATRA对前列腺癌PC-3，PC-3／TK‘细胞旁观者效应，RT-PCR检测AT-RA诱导Cx43mRNA表达的作用。结果ATRA显著提高PC-3／TK对GCV的敏感性。在100p．mol／L更昔洛韦（GCV）作用下，以10“mmol／LATRA与不加ATRA的作用比较，在PC-3，PC-3／TK不同比例混合的各组中，细胞的存活率明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。并观察到10“mmol／LATRA对GCV旁观者效应的增强作用。RT-PCR结果表明，经ATRA处理的PC-3细胞，其Cx43mRNA的相对拷贝数比值增高约10倍。结论前列腺癌PC-3细胞中，10^-6mmol／LATRA具有明显增强HSV-tk／GCV旁观者效应的作用。其主要机制是通过ATRA在转录水平诱导Cx43mR-NA表达上调，导致旁观者效应的增强     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞，用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF-7，G418筛选出阳性细胞MCF-7／CD tk，然后加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Fc)或／和丙氧鸟苷(GCV)，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的MCF-7／CD tk和MCF-7细胞混合，联合应用5-Fc和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5-Fc或GCV均能对MCF一7／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用．其旁观者效应明显。     

全反式维甲酸增强雄激素非依赖性前列腺癌自杀基因治疗旁观者效应的实验研究

目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）对腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶（Ad-TK）／N氧鸟苷（GCV）治疗激素非依赖性前列腺癌旁观者效应的影响及其机理。方法 采用免疫细胞化学和Western blot方法检测ATRA作用前后前列腺癌细胞株PC-3表达连接蛋白（Cx）43的水平和位置，应用MTT法检测细胞存活率，观察ATRA处理前后Ad—TK／GCV系统治疗PC-3细胞旁观者效应的变化。结果 PC-3细胞弱表达Cx43，总体表达率为27．7％；在浓度〉1×10^-6mol／L的ATRA作用下，Cx43水平表达阳性率达75．7％，以胞膜表达为主，明显高于ATRA处理前（P〈0．05）。在达到明显旁观者效应（细胞生存率50％）时，Ad—TK／GCV系统组需要TK^＋PC-3细胞数为50％，而ATRA联合Ad—TK／GCV系统组需要TK^＋PC-3细胞数仅为30％，二者比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 前列腺癌Ad—TK／GCV治疗的旁观者效应与Cx43表达及定位有关，AT—RA可以通过提高Cx43的表达增强旁观者效应。     

全反式维甲酸提高激素非依赖性前列腺癌自杀基因治疗的旁观者效应

目的：观察全反式维甲酸（ATRA）提高单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）／N氧鸟苷（GCV）系统体内外抗激素非依赖性前列腺癌的旁观者效应。方法：应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞存活率来反映ATRA处理前后HSV-TK／C,CV系统治疗PC-3细胞的旁观者效应；荷前列腺癌裸鼠模型随机分为4组，观察各组移植瘤生长状态和组织病理学改变。结果：在达到明显旁观者效应时，HSV-TK／GCV需要TK^＋ PC-3细胞数为50％，而ATRA联合HSV-TK／GCV需要TK^＋ PC-3细胞数仅为30％，两者比较差异显著（P〈0．05）。HSV-TK可以抑制移植瘤生长，但ATRA＋HSV-TK抗前列腺癌发生显效可提前1周，而且效果更显著（P〈0．05）。结论：ATRA可增强HSV-TK／GCV系统治疗激素非依赖性前列腺癌的旁观者效应。     

双自杀基因HSV-tk/CD对胆管癌体内体外旁观者效应的研究

目的研究双自杀基因HSV鄄tk/CD的体内外旁观者效应。方法在体外将tk/CD阳性的胆管癌QBC939细胞与亲本细胞按不同的比例混合,并与单自杀基因组对照,观察给予前体药物后对混合细胞的生长抑制情况。建立荷瘤裸鼠模型,在瘤体内注入不同数量的tk/CD阳性胆管癌细胞,观察给予前药后的旁观者效应。结果融合基因组在体外产生明显强于单基因组的BSE,tk组的BSE出现较晚,阳性细胞的比例需达到40%,而CD组和融合基因组中,阳性细胞仅占20%时,就可观察到明显的BSE。体内实验也观察到BSE,强度与注入阳性细胞数有关(P<0.05);本研究没有观察到“远处旁观者效应”。结论腺病毒介导的双自杀基因HSV鄄tk/CD在体外和体内均可产生旁观者效应。     

逆转录病毒载体介导TK/GCV与CD/5FC双自杀基因治疗肝细胞肝癌的研究

目的 探讨TK与CD双自杀基因对肝癌细胞的杀伤作用及旁观者效应，并在前药用量、杀伤效力及旁观者效应强弱等方面，与单自杀基因比较。方法 将TK与CD双自杀基因导入肝细胞肝癌细胞系HCC-9903，用不同浓度更昔洛韦(GCV)及5氟胞嘧啶(5FC)、不同混育比例及不同混育时间分别作用于细胞，观察在这些条件下的杀伤效应及旁观者效应。结果 GCV与5FC的有效浓度范围分别是大于10^-2μg/ml及大于2mmol／L，混育96h杀伤作用明显高于24h。HCC-9903／TK CD细胞占5％以上，即可观察到旁观者效应。结论 以脂质体介导成功将双自杀基因TK与CD感染肝细胞肝癌细胞系HCC-9903，双自杀基因具有强大杀伤作用，较单自杀基因更为明显，其前药用量减少，降低了药物的毒副作用，旁观者效应更为强大。其杀伤作用与前药浓度、混育比例及混育时间呈正相关。     

三参数流式细胞术分析紫外线诱导的MOLT-4细胞旁观者效应

目的 应用三参数流式细胞术探讨紫外线(UV)诱导的MOLT-4细胞的旁观者效应(BSE).方法 以人类T细胞白血病细胞株MOLT-4为对象,以紫外线为诱导剂.将经UV照射的MOLT-4细胞与DiD荧光阳性的MOLT-4细胞联合培养作为试验组,未经任何打击的DiD阳性细胞为对照组.用FITC-Annexiu V/PI法检测细胞凋亡率,用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察其荧光及形态学改变,以检测其旁观者效应.结果 实验组中旁观者细胞凋亡及坏死比例在0、2、4、8、12、18、24 h分别为6.84%、8.09%、9.88%、13.50%、22.50%、30.99%、37.93%.而对照组为4.28%、4.93%、5.22%、5.39%、6.54%、6.77%、7.14%.试验组旁观者细胞的凋亡及坏死比例随着时间的延长而逐步增高.LSCM观察可见部分旁观者细胞出现磷脂酰丝氨酸(PS)翻转、核边集、核浓集、核碎裂等形态学改变.结论 在MOLT-4细胞株,用非离子射线--UV诱导的凋亡细胞对联合培养的旁观者细胞具有旁观者效应.     

HSV-TK/GCV系统对前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应

目的 :研究胸苷激酶 (TK)自杀基因疗法对人前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应 ,探讨其治疗前列腺癌的可行性。方法 :采用形态学观察、活细胞拒染法及MTT法检测单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK) /羟基无环鸟苷 (GCV)系统对前列腺癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果 :GCV对转染TK基因前列腺癌细胞的杀伤作用呈剂量及时间依赖关系 (P <0 .0 5～ 0 .0 1) ;但其旁观者效应较弱 ,TK基因阳性细胞比例约为 10 %的混合细胞 ,经 10 μmol/L和 10 0 μmol/L的GCV处理 72h后 ,仅有16.15 %± 1.64 %和 2 3 .46%± 3 .2 1%的细胞被杀灭。结论 :HSV TK/GCV系统对前列腺癌有杀伤作用 ,但由于其旁观者效应不够强大 ,不能期望通过单纯的TK基因治疗达到前列腺癌良好的治疗效果     

间隙连接蛋白43与自杀基因系统旁观者效应的关系

目的 观察胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因对胆管癌细胞和胆管癌移植瘤的作用以及转染间隙连接蛋白43(Cx43)基因对旁观者效应的影响.方法 MTT法比较双自杀基因系统作用下和(或)Cx43基因转染后QBC939细胞的细胞抑制率及旁观者效应. 前体药物应用前、后测量移植瘤的大小,判断自杀基因系统的作用和Cx43蛋白对旁观者效应的影响.结果 CD和HSV-tk基因在转染细胞中获稳定表达. mRNA和蛋白水平均显示CD tk Cx 细胞中Cx43的表达量增加. 自杀基因系统对CD tk Cx 细胞组和它生成的移植瘤组的抑制作用均比CD tk 细胞组高.结论 双自杀基因系统在体内、外对胆管癌细胞和移植瘤均有明显的抑制作用,Cx43基因导入可明显增强旁观者效应和对肿瘤的抑制作用.     

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的　研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法　将GBC SD/CD tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果　单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论　双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。     

miR-4655-3p在中波紫外线旁观者效应中的作用研究

目的:探讨miR-4655-3p在中波紫外线旁观者效应中的作用。方法:使用miR-4655-3p抑制剂(inhibitor)或其对应的阴性对照(negative control,NC)转染人皮肤成纤维细胞(HSFs)后,对不同组HSFs进行UVB(60mJ/cm~2)单次照射,照光后24h取细胞培养上清液与正常HSFs共孵育48h,分别测定细胞增值率、氧化损伤水平及凋亡率。结果:inhibitor转染组细胞中miR-4655-3p相对表达量较NC转染组明显降低(P0.05);照光后,inhibitor转染组细胞、细胞培养上清液及该上清液孵育的HSFs中miR-4655-3p的相对表达量较NC转染组显著降低(P0.05);与NC组旁观者细胞相比,Inhibitor组旁观者细胞的增殖率增加,氧化损伤水平及凋亡率减少,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:miR-4655-3p在中波紫外线旁观者效应中发挥作用,抑制其表达可在一定程度上减弱紫外线旁观者效应。     

携带tk基因的EB病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导,？…

研究携带ｔｋ基因ＥＢ病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导，杀伤和旁观者效应。方法设更昔洛韦组、阿昔洛韦组和对照组共３组，脂质体包裹质粒转染人肝癌细胞后分别加入不同浓度药物；已转染基因的细胞与未转染的细胞不同比例混合，每孔分别加入ＧＣＶ。     

联合应用双自杀基因对SW1990细胞的杀伤作用

目的:研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对 SW1990细胞的杀伤作用和旁观者效应.方法:脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞,用其病毒上清转染胰腺癌细胞SW1990,G418筛选出阳性细胞SW1990/CD tk,然后加入不同浓度的5-Fc或/和GCV,MTT法观察其杀伤作用;将不同比例的SW1990/CD tk和SW1990细胞混合,联合应用5-Fc和GCV杀伤,观察其旁观者的效应.结果:单独应用5-Fc或GCV均能对转染阳性的胰腺癌细胞产生明显的杀伤效应,联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用;当阳性细胞比例达到20%时即可对半数细胞产生杀伤作用.结论:双自杀基因的应用对胰腺癌细胞具有明显的杀伤作用,其旁观者效应明显.     

双自杀基因重组腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用

目的构建含CD／UPRT双自杀基因的重组腺病毒Ad—CD／UPRT，观察其对人肺腺癌细胞的杀伤作用。方法用0～100感染复数的重组腺病毒转染肺腺癌A549细胞后加入（0～1000）mg／L的5-氟胞嘧啶（5-FC），MTT法检测杀伤效率；将转基因细胞与未转基因细胞按不同比例混合，观察旁观者效应。结果Ad-CD／UPRT转染A549后对细胞生长有显著的抑制作用，细胞杀伤效率随腺病毒滴度及5-FC浓度的增加而增强；转基因细胞占混合细胞10％以上，即可观察到明显的旁观者效应。结论Ad—CD／UPRT联合5-FC对肺腺癌A549细胞有显著杀伤作用。     

携带tk基因的EB病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导、杀伤和旁观者效应

目的　研究携带ｔｋ 基因ＥＢ病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导、杀伤和旁观者效应。方法　设更昔洛韦（ＧＣＶ）组、阿昔洛韦（ＡＣＶ） 组和对照组共３ 组,脂质体包裹质粒转染人肝癌细胞后分别加入不同浓度药物;已转染基因的细胞与未转染的细胞不同比例混合,每孔分别加入ＧＣＶ。样本７２ 小时后ＭＴＴ比色法检测杀伤和旁观者效应。结果　ＧＣＶ 或ＡＣＶ 均在０ ．２μｍｏｌ／Ｌ浓度即可对转染ｔｋ 基因的肝癌细胞产生杀伤作用并依浓度呈梯度变化。ＧＣＶ 在转染／未转染肝癌细胞１∶５ 的混合比率时即可产生明显的旁观者效应。结论　ＥＢ 病毒复制子载体适合携带ｔｋ 自杀基因用于肝癌基因治疗。