聚酰胺-胺型树形分子脂质体对人结肠癌细胞摄入和细胞毒性的影响

目的 研究聚酰胺-胺型树形分子(PAMAM)脂质体对人结肠癌细胞摄入和细胞毒性的影响.方法 以1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)为材料制备脂质体,将质粒PEGFP-N1与脂质体和PAMAM混合分别制备PAMAM脂质体/DNA转染复合物和PAMAM/DNA转染复合物.透射电镜观察转染复合物的形态、粒径,zeta电位分析仪测定载质粒纳米粒子的zeta电位,离心法和紫外分光分度仪测定载质粒纳米粒子的包封率,将上述两种载质粒纳米粒子转染人结肠癌细胞SW620、人乳腺癌细胞MCF-7、血管内皮细胞ECV304,流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的入胞量,MTT法对PAMAM脂质体/DNA复合物和PAMAM/DNA复合物的毒性进行评价.结果 PAMAM脂质体载质粒纳米粒子的粒径与PAMAM载质粒纳米粒子的粒径差异无统计学意义[(192±16)nm比(189±19)nm,P＞0.05],zeta电位前者高于后者[分别为(42±7)mV和(32±7)mV,P＜0.05],包封率两者之间差异无统计学意义[(82±7)%比(84±6)%,P＞0.05].PAMAM脂质体载质粒纳米粒子和PAMAM载质粒纳米粒子转染SW620、MCF-7、ECV304细胞后,PAMAM脂质体/DNA组细胞EGFP基因摄入量高于PAMAM/DNA组,差异有统计学意义(P＜0.05).前者细胞存活率高于后者,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脂质体修饰聚酰胺-胺型树形分子可提高基因转染细胞的效率,降低细胞毒性.     

基因靶向抑制反义生存素对脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨反义生存素（Survivin）脂质体复合物对脑胶质瘤细胞增殖和凋亡效应的影响及机制，为脑胶质瘤Survivin基因靶向治疗提供理论依据。方法用脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染脑胶质瘤细胞系U251细胞；Western印迹试验检测Survivin表达水平变化；噻唑蓝（MTT）法测量细胞生长情况；流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位变化；电镜倒置显微镜观察细胞形态学变化；应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物对Survivin蛋白的影响。结果反义Survivin脂质体复合物能有效下调Survivin表达水平。肿瘤细胞凋亡率随转染时间延长而逐渐递增。并出现凋亡形态学变化。免疫荧光分析中标记有绿色荧光染色的Survivin蛋白分子在未转染的细胞浆中清晰可见。并呈斑点状分布；而在转染细胞中几乎没有发现。结论靶向抑制Survivin基因在脑胶质瘤未来治疗中有良好的应用前景。     

聚酰胺-胺型树状聚合物介导基因转染的实验研究

目的 探讨聚酰胺-胺型树状聚合物(PAMAM)作为基因载体,体外转染成纤维细胞的可行性.方法 ①将pEGFP与PAMAM按不同电荷比混合,通过原子力显微镜(AFM)对PAMAM和PAMAM-pEGFP复合物进行粒径、形态的表征;凝胶电泳实验和Zeta电位实验检验PAMAM与pEGFP质粒在不同电荷比时形成复合物的能力;通过DNA共沉淀试验检测不同电荷比下PAMAM对质粒pEGFP的包封率.②将不同电荷比的PAMAM-pEGFP复合物转染至小鼠胚胎成纤维细胞系,48 h后荧光显微镜下观察转染情况.③CCK-8实验检测转染后细胞的增殖活性.结果 PAMAMpDNA复合物的粒径约10 nm.PAMAM在电荷比大于2时就能有效包裹质粒.随电荷比的增加,复合物的Zeta电位增加,在溶液中的稳定性和分散性也提高.包封率在电荷比为4∶1时达95％.转染效率随电荷比的增加呈增高趋势,其中在4∶1和6∶1时转染效率达到最高.细胞毒性与电荷比有关,电荷比大于6∶1时,PAMAM对细胞生长有毒性作用.结论 PAMAM纳米载体可安全有效地介导基因转染,是一种理想的基因递送系统.     

YAP1在结直肠癌组织中的表达及意义

目的:探讨Yes相关蛋白1(YAP1)在结直肠癌组织中的表达,以及沉默YAP1基因对结直肠癌SW620细胞增殖和侵袭的影响。方法:选取2015年5月—2017年5月行手术治疗的结直肠癌患者108例,免疫组织化学法检测结直肠癌和癌旁组织中YAP1蛋白表达,培养SW620细胞并分为si RNA-YAP1组、si RNA-对照组和空白组,分别转染YAP1干扰物、阴性对照序列和不作任何处理。实时荧光定量PCR技术检测细胞中YAP1表达,MTT法和平板克隆形成实验检测细胞增殖力,Transwell法检测细胞侵袭力。结果:YAP1蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率为74.07%,高于癌旁组织的21.30%,差异有统计学意义(χ2=60.296,P0.001);YAP1蛋白阳性表达率在不同TNM分期和是否发生淋巴结转移的结直肠癌组织中差异有统计学意义(P0.05);si RNA-YAP1组细胞中YAP1 mRNA相对表达量低于si RNA-对照组和空白组(P0.05);si RNA-YAP1组细胞吸光度值(24、48、72和96 h时)及细胞克隆形成数均低于si RNA-对照组和空白组(P0.05);si RNA-YAP1组侵袭细胞数少于si RNA-对照组和空白组(P0.05)。结论:YAP1蛋白在结直肠癌组织中呈高表达,且与肿瘤发生及恶性进展有关,沉默结直肠癌SW620细胞中YAP1基因表达可明显减少细胞增殖,抑制细胞侵袭力。     

TrkB影响结肠癌细胞SW620侵袭能力及与ERK信号通路活化关系的研究

目的:探讨干扰结肠癌细胞TrkB蛋白表达及抑制ERK活化对细胞增殖、凋亡和侵袭以及细胞内ERK磷酸化水平的影响。方法:应用特异性TrkB-siRNA瞬时转染及ERK特异性抑制剂处理SW620结肠癌细胞,观察SW620细胞增殖、凋亡和侵袭情况以及细胞内ERK磷酸化水平的变化。结果:特异性siRNA转染高表达TrkB的SW620细胞,TrkB蛋白表达减少,ERK的磷酸化水平降低,且转染组细胞数显著低于对照组(P=0.001),转染组的细胞凋亡率显著高于对照组(P=0.000 1),24 h后侵袭至下层小室的细胞数转染组显著低于对照组(P=0.001);ERK抑制剂明显降低SW620细胞ERK磷酸化水平(P=0.001),而对ERK蛋白表达没有影响,且应用ERK抑制剂作用SW620细胞,对照组和处理组中细胞数没有显著差异(P=0.544),对照组和处理组中SW620细胞的凋亡率差异无统计学意义(P=0.103),但对照组24 h后侵袭至下层小室的细胞数显著高于处理组(P=0.0001)。结论:干扰TrkB蛋白表达能够降低高转移结肠腺癌SW620细胞内ERK磷酸化水平,促进细胞凋亡并抑制细胞增殖和侵袭。同时应用ERK特异性抑制剂也显著抑制细胞侵袭。因此ERK信号转导通路可能与TrkB介导的结肠腺癌细胞抗凋亡和侵袭能力的增加相关,沉默TrkB表达可能成为阻断结肠癌转移的新靶点。     

CXCR3在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨CXCR3在结直肠癌组织中的表达及其临床意义.方法 应用SP免疫组织化学方法检测52例结直肠癌组织CXCR3的表达,Western印迹和体外迁移实验检测趋化因子受体CXCR3在大肠癌细胞株SW480、SW620、HT29细胞的表达及迁移能力.结果 CXCR3的阳性表达率为88%(46/52),CXCR3的高表达与结直肠癌患者的年龄、性别、结直肠癌组织类型、分化程度无关,而与临床转移(肝脏、淋巴结转移)有关(x2=12.1、21.5,P＜0.01).SW480、SW620及HT29的CXCR3表达均呈阳性,其中大肠癌细胞HT29和SW620 CXCR3高表达,大肠癌细胞SW480 CXCR3低表达.在体外迁移实验中,大肠癌细胞HT29和SW620发生体外迁移细胞明显增多(75±6比147±8、63±5比9l±6,P＜0.01),而大肠癌细胞SW480体外迁移无明显变化(47±4比45±3,P>0.05).结论 CXCR3上调表达与结直肠癌转移有关.     

CUGBP1在结直肠癌组织中的表达及对细胞增殖和侵袭力的影响

目的 :探讨CUG连接蛋白1(CUGBP1)在结直肠癌组织中的表达,以及特异性沉默结直肠癌SW620细胞中CUGBP1基因表达对细胞增殖和侵袭力的影响。方法:选取2015年3月—2017年12月择期行手术治疗的结直肠癌患者107例,免疫组化法检测结直肠癌和癌旁组织中CUGBP1蛋白表达,培养人结直肠癌SW620细胞,分为干扰序列组、阴性对照组和对照组,实时荧光定量PCR技术检测细胞中CUGBP1基因,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞侵袭力。结果:结直肠癌组织中CUGBP1蛋白阳性表达率77.57%,高于癌旁组织的38.32%,差异有统计学意义(χ2=33.826,P=0.000);结直肠癌组织中CUGBP1蛋白表达与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P0.05);干扰序列组细胞中CUGBP1 m RNA相对表达量低于阴性对照组和对照组,差异有统计学意义(P0.05);干扰序列组细胞24h、48h、72h和96h时吸光度A值低于阴性对照组和对照组,差异有统计学意义(P0.05);干扰序列组侵袭细胞数少于阴性对照组和对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:CUGBP1蛋白在结直肠癌组织中呈高表达,特异性沉默结直肠癌SW620细胞中CUGBP1基因表达可有效抑制细胞增殖和侵袭力。     

结直肠癌中缺氧诱导因子-1α与Survivin表达的关系

目的 探讨结肠癌LS174T细胞及结直肠腺癌组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及与Survivin的关系.方法 构建靶向HIF-1α的质粒pSilence-2.1-U6-siRNA并鉴定,采用阳离子脂质体转染法将其转染LS174T细胞,低氧培养24h,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测siRNA对HIF-1α的抑制作用.Western blot检测Survivin蛋白表达.应用免疫组织化学方法检测69例人结直肠腺癌组织中HIF-1α、Survivin蛋白的表达.结果 LS174T细胞转染靶向HIF-1α的siRNA表达载体后,HIF-1α、Survivin表达显著下降.69例结直肠腺癌组织中,HIF-1α、Survivin蛋白的阳性表达率为66.7％ (46/69)和56.5％ (39/69).腺癌组HIF-1α蛋白阳性表达率显著高于腺瘤组(P＜0.01).Ⅲ期腺癌HIF-1α蛋白表达显著高于Ⅰ～Ⅱ患者(P＜0.05).结直肠腺癌中HIF-1α表达与Survivin显著正相关.结论 结直肠腺癌发展过程中HIF-1α与Survivin表达密切相关.     

C/EBPα在结肠直肠癌的表达及对癌细胞的作用

目的:检测C/EBPα在结肠直肠癌中的表达情况,探讨下调C/EBPα表达对结肠癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法:利用RT-PCR和免疫组织化学技术检测C/EBPα在结肠直肠癌组织及相邻正常组织中的表达,分析C/EBPα表达与临床病理特征的关系。用Western印迹法筛选C/EBPα,发现SW620为高表达C/EBPα肠癌细胞株。通过RNA干扰技术下调结肠癌细胞株SW620中C/EBPα表达后,利用CCK8和流式分析技术检测SW620细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化。结果:C/EBPα在结肠直肠癌组织中高表达,且与肿瘤浸润深度有关(P<0.05),促进SW620细胞凋亡(P     

靶向细胞外信号调节激酶2短发夹式RNA对人食管癌Eca109细胞增殖的影响

目的 观察靶向细胞外信号调节激酶2(ERK2)短发夹式RNA(shRNA-ERK2)对人食管癌细胞株Eca109细胞增殖的影响.方法 构建重组质粒pGeneClipTM-shRNA-ERK2脂质体介导重组质粒转染人食管癌Eca109细胞,荧光倒置显微镜观察转染效率;噻唑蓝(MTT)比色法检测转染食管癌Eca109细胞后细胞的增殖能力;Western blot检测转染后食管癌Eca109细胞ERK2基因的表达和凋亡抑制基因Survivin的表达.结果 测序证实载体构建成功,荧光倒置显微镜观察转染后72 h转染效率50%～70%;转染重组质粒96 h后食管癌Eca109细胞生长抑制率最高为10.45%,与阴性对照组(非特异性序列对照)和空白对照组比较抑制效果明显(P＜0.05);转染重组质粒72 h和96 h后食管癌Eca109细胞株中ERK2和Survivin的表达与U0126对照组和阴性对照组比较均下降(P＜0.05).结论 重组质粒pGeneClipTM-shRNA-ERK2在食管癌Eca109细胞株中能发挥靶基因沉默作用,影响Survivin基因的表达,抑制食管癌细胞增殖.     

Modification of gene products involved in resistance to apoptosis in metastatic colon cancer cells: roles of Fas, Apaf-1, NFkappaB, IAPs, Smac/DIABLO, and AIF

BACKGROUND: Colon cancer becomes resistant to apoptosis as it acquires metastatic potential. SW480 and SW620 colon cancer cells were established from the same patient at different stages of tumor progression. The stage III colorectal cancer cell line (SW620) is more resistant to apoptosis. In the present report, we investigated the apoptotic gene products that might account for colon cancer evasion of immune attack and chemoradioresistance-induced apoptosis. METHODS: SW480 and SW620 cells were used for this experiment. Type 1 apoptosis was induced by CH-11. Type 2 apoptosis was induced by cisplatin and ionizing radiation. Apoptosis was determined by caspase-3 activity and terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling. Gene products Fas, TRAIL, c-FLIP, Bid, BAX, Bcl-2, Bcl-xL, Apaf-1, nuclear factor-kappa B, Smac/DIABLO, apoptosis inducing factor, and the inhibitors of apoptosis were investigated by immunocytochemistry and Western blot analyses. RESULTS: SW620 cell lines were more resistant to both Type 1 and Type 2 apoptosis induced by CH-11, cisplatin, and ionizing radiation, respectively. Examination of the extrinsic pathway demonstrated Fas receptor to be down-regulated in SW620. Apaf-1 was decreased in SW620 cells; while other members of the mitochondrial pathway including Bax, Bid, Bcl-xL, and Bcl-2 demonstrated minimal alterations of protein levels in both cell lines. Survivin and XIAP protein levels were increased in SW620 cells, which correlated with nuclear expression of nuclear factor-kappa B in SW620 cells but not SW480. Mitochondrial-released factors including Smac/DIABLO and apoptosis inducing factor were increased in SW480 cells. CONCLUSIONS: SW620 cells have acquired genetic defects both in the intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis, which may explain in part the ability of colon cancer cells to escape the immune system and to become chemoradioresistant. These genes may be potential targets for chemoradiosensitization in advanced colorectal cancer.     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

血管内皮生长因子受体启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸对结直肠癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的CDglyTK融合基因（AdKDR-CDsbrTK）体系联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对结直肠癌细胞（sw620）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增产生重组腺病毒。体外感染表达KDR的SW620、ECV304细胞株,同时用survivin ASODN转染同一细胞株,观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况。应用RT．PCR和Western印迹检测CDglyTK和survivin基因的表达．MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果survivin ASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并且两者的转染及感染效率无明显变化。CDglyTK可在SW620、ECV304细胞株高效表达。survivin ASODN可明显降低survivin蛋白表达。各基因治疗组细胞存活率明显低于阴性对照组（P〈0．001）。survivinASODN与AdKDR—CDglyTK基因联用后。随着前药浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异具有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5-FC 2000μg／ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK,两者间差异无统计学意义（P〉0．05）。Survivin ASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用,在前药浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的AdKDR-cDglyTK体系和survivin ASODN基因联合,较单一基因具有更强的特异性杀伤结直肠癌细胞及血管内皮细胞的作用。     

RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

miR-338-5p在结直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的探讨miR-338-5p在结直肠癌组织中的表达状况,以及miR-338-5p过表达对结肠癌细胞系HCT116和SW620增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法使用实时定量PCR方法检测miR-338-5p在40例临床诊断为结直肠癌患者配对癌组织及癌旁组织中的表达情况。随后使用miR-338-5p-mimics转染结肠癌细胞系HCT116和SW620,确认过表达成功后,分别使用CCK-8法、FITC-AnnexinV．PI法及Propidiumiodide法检测肿瘤细胞的增殖、凋亡和细胞周期的改变。结果①miR-338-5p在结直肠癌组织中的表达明显低于其在相应的癌旁组织中的表达（P〈0．01）。②与转染阴性对照比较,转染miR-338．5p．mimics后,HCT116和SW620细胞增殖能力明显减弱（P〈0．01）,凋亡率明显增加[HCT116细胞：（11．43±0．67）％比（7．98±0．36）％,P〈0．01;SW620细胞：（10．5±0．2）％比（7．93±0．5）％,P〈0．01],诱导HCT116和SW620细胞G1期阻滞[HCT116细胞：（80．41±1.34）％比（64．87±1．83）％,P〈0．01;SW620细胞：（68．76±0．41）％比（54．89±0．78）％,P〈0．01]。结论miR-338-5p可能作为抑癌基因在结直肠癌中发挥作用,并对细胞增殖、凋亡和周期有显著影响。