CD59 RNAi逆转录病毒载体转染卵巢癌细胞株A2780的构建

目的获得携带针对人CD59基因p SUPER retro RNAi逆转录病毒载体的卵巢癌细胞株A2780。方法设计能转录产生靶向CD59小发夹RNA(sh RNA)转染逆转录病毒载体p SUPER retro neo+gfp质粒,构建p SUPER-si CD59重组质粒,将重组质粒导入卵巢癌细胞株A2780内。鉴定转染后细胞株能形成稳定的扩增。结果重组质粒经PCR凝胶电泳、核苷酸测序证实与设计序列一致;重组质粒转染卵巢癌细胞株A2780,可稳定表达绿色荧光蛋白。结论携带针对人CD59基因p SUPER retro RNAi逆转录病毒载体的卵巢癌细胞株A2780的建立为深入进行肿瘤细胞研究奠定了基础。     

靶向EBV潜伏期基因EBNA2小干涉RNA系统的构建

[目的]构建携带靶向EBV核抗原EBNA2(EBV nuclear antigen,EBNA)的pSUPER.retroRNAi逆转录病毒载体,进而筛选出稳定产毒的细胞克隆。[方法]用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向EBNA2小发夹RNA(smallhairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列定向插入逆转录病毒载体pSUPER.retro,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PheonixA,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。[结果]重组逆转病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7167bp和281bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染的包装细胞经G418筛选获得能产生逆转录病毒的抗性细胞克隆,病毒滴度为2.5×104CFU/ml。[结论]成功构建和筛选出靶向EBV潜伏期基因EBNA2的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系,为深入探讨EBNA2基因的细胞转化和抗凋亡作用提供了实验基础。     

pLXSN-bcr/abl质粒载体的构建及其逆转录病毒的生成

目的:构建bcr/abl融合基因的逆转录病毒载体,通过细胞包装获取高滴度含bcr/abl基因的逆转录病毒.方法:RT-PCR法克隆K562细胞bcr/abl基因断裂点DNA片段,构建pLXSN-bcr/abl表达载体;阳离子脂质体法将重组体转染EcoPack2TM-293包装细胞,序列测定鉴定病毒并测定病毒滴度.结果:成功构建pLXSN-bcr/abl重组体,序列测定与已知相应bcr/abl融合基因序列相同;脂质体法将重组体转染293包装细胞获得携带bcr/abl基因病毒,测滴度为6×105 cfu/mL.结论:成功构建pLXSN-bcr/abl表达载体,并获得高滴度含bcr/abl融合基因的逆转录病毒.     

重组人GM-CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的　建立逆转录病毒介导的 GM- CSF基因转移系统 ,为 GM- CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法　应用基因重组技术将 GM- CSF c DNA克隆于逆转录病毒载体p DORneo,获得重组载体 p DORGM。经脂质体介导将其转染于病毒包装细胞系 PA317细胞 ,经NIH3T3细胞检测病毒滴度 ,NIH3T3放大实验检测辅助病毒 ,并用高滴度病毒感染人乳腺癌细胞系MCF- 7。结果　GM- CSF基因克隆入逆转录病毒载体 ,经 PA317细胞包装产生病毒 ,最高的病毒滴度为 1× 10 6CFU/ ml,且没有发现辅助病毒存在。重组病毒感染的人乳腺癌 MCF- 7细胞在体外长期培养中保持稳定分泌 GM- CSF,活性在 50 0～ 80 0 U/ 10 6细胞 / 2 4小时。结论　建立的逆转录病毒介导的GM- CSF基因转移系统安全、有效 ,为 GM- CSF应用于肿瘤基因治疗提供了实验基础。     

MIG7-shRNA逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞株的建立

目的:构建迁移诱导基因（migration inducing gene 7,MIG7）的逆转录病毒表达载体并测序,初步建立其包装细胞株。方法:根据MIG7已知序列设计合成所需脱氧寡核苷酸序列,并与线性RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体连接。PCR扩增热转化后的连接产物,检测和挑取阳性克隆和阳性菌落,提取质粒后测序,与Gen-Bank中特异性MIG7-shRNA基因序列对比。包装并获取MIG7-shRNA重组逆转录病毒,qRT-PCR测定MIG7-shRNA重组逆转录病毒滴度并转染MHCC-97H细胞株。结果:构建的MIG7-shRNA表达载体与设计的完全一致,成功获得MIG7-shRNA逆转录病毒表达载体质粒CTC698-1-1和CTC698-2N-1转染的PT67细胞克隆株,pSIREN-M1病毒和pSIREN-MN病毒颗粒数约为1.0×108v.p/ml,能高效转染MHCC-97H细胞株。结论:成功构建了MIG7的逆转录病毒表达载体并建立其包装细胞株。     

一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建

 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAd—BM5-GFP-mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增mAFP基因，测序确认后，插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCBn法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3．2×10^8PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。     

iNOS基因转染人CD3AK细胞的实验研究

目的　构建一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞。方法　用PCR技术从 pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒 pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。用病毒上清感染人CD3AK细胞。测定CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量及iNOS活性。结果　经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒的正确性。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1× 10 4CFU /ml。经重组逆转录病毒上清转染后CD3AK /iNOS细胞合成并分泌的NO含量及iNOS活性比CD3AK细胞明显增高。结论　逆转录病毒载体 pLNCX可有效地介导iNOS的转染。成功构建CD3AK/iNOS细胞 ,有效提高iNOS活性及NO含量。     

导入Rb、p53、p16和H-ras反义RNA对人胃癌细胞恶性增殖的影响

构建Rb、p16、p53、H-ras反义RNA的逆转录病毒载体,利用脂质体介导和病毒感染的方法将其分别转入—存在Rb基因部分缺失、p16低表达、p53缺失和H-ras点突变的胃癌细胞系.观察这些基因对该细胞生长及致癌性的影响,探讨肿瘤相关基因在人胃癌发生、发展过程中的作用.结果表明,通过基因重组技术将多种基因分别重组至逆转录病毒载体PLXSN中,经鉴定获得正插及反插有该基因的重组质粒.将这些质粒分别用脂质体介导和病毒感染的方法转染BGC823细胞,G418筛选2～3周后,获得较高的转染效率.对转染后细胞DNA、RNA进行分析,证明外源性基因已整合人BGC823细胞并获稳定表达.表达有外源性p16、p53基因和H-ras反义RNA的裸鼠致癌性均有明显的抑制作用,而Rb基因对BGC823的恶性增殖能力没有明显抑制.这一结果表明p16、p53、H-ras几个基因的异常可能是导致这一个细胞癌变及最终发展成胃癌的主要原因.本实验进一步明确了胃癌的发生、发展是多基因变异累积的结果.     

腺病毒介导靶向碱性成纤维细胞生长因子siRNA载体的构建及鉴定北大核心CSCD

目的构建一种高效"沉默"碱性成纤维细胞生长因子的小干扰RNA重组腺病毒载体,并为该载体在基因研究中提供相关资料。方法设计、合成优选的靶向bFGF特异性siRNA序列。采用限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方法,将bFGF-siRNA序列克隆至腺病毒穿梭质粒pGStrack上,然后将重组穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA和腺病毒骨架质粒pGSadeno体外LR位点进行特异性重组,将bFGF-siRNA基因转移至腺病毒骨架质粒pGSadeno上,最后重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA。鉴定正确后经Pac Ⅰ酶切,转染HEK 293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA。同时在HEK 293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度,用Western blot方法验证所构建载体作用效果。结果 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA构建成功;扩增后检测腺病毒滴度约为5×108 PFU/ml,Western blot结果显示目的基因蛋白沉默效率大于90%。结论应用LR重组法能成功构建携带靶向bFGF基因的siRNA重组腺病毒,该载体转染胶质瘤U251细胞株后目的基因蛋白沉默效率较高,为进一步的相关研究奠定可靠的基础。     

Pharmacogénétique des fluoropyrimidines. La méthylènetétrahydrofolate réductase

Résumé: Lefficacité optimale des fluoropyrimidines nécessite des concentrations élevées en 5-10 méthylènetétrahydrofolate (CH₂FH₄), contrôlées par la méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR) qui convertit irréversiblement le CH₂FH₄ en 5-méthyltétrahydrofolate (CH₃FH₄). Les polymorphismes 677CT et 1298AC du gène MTHFR sont associés à une baisse dactivité de lenzyme. Les tumeurs «MTHFR mutées» devraient donc être plus sensibles aux fluoropyrimidines que les tumeurs «MTHFR sauvages». Les études expérimentales et cliniques publiées à ce jour tendent à montrer une plus grande sensibilité au 5-FU (associé ou non à lacide folinique) dans les tumeurs MTHFR mutées par rapport aux tumeurs sauvages. Ces résultats montrent la nécessité de poursuivre ces recherches afin de confirmer limpact de ces polymorphismes sur lefficacité des fluoropyrimidines.     

裘法祖教授生平

Prof.Fazu Qiu,member of the Chinese Communist Party,surgery professor of Tongji Hospital,departed in Tongji Hospital,Wuhan,China,at fourteen to nine a.m,June 14,2008,after a disease.He turns 94 this year.He was the senior academician of the Academia Sinica,the illustrious medical scientist of China,and the Honorary Director of Tongji Medical College,as well as Huazhong University of Science & Technology.     

Oncogénétique et psycho-oncologie, une collaboration recommandée...

Résumé: La possibilité depuis 1994, de connaître la probabilité individuelle de développer certains cancers a permis de proposer de nouvelles modalités de prévention, de traitements et contribué au développement actuel de loncogénétique. Une meilleure connaissance des répercussions psychologiques tant pour les patients que pour les apparentés est désormais possible et limplication des psycho-oncologues dans ce cadre de la réalisation des tests prédictifs, recommandée. La mission de «messager» qui incombe au «cas-index» doit faire lobjet dune attention particulière. La complexité de linformation et la dimension paradoxale que peut avoir parfois la communication à propos des choix, rend difficile lévaluation de la qualité du consentement. La situation particulièrement délicate dune aide à la décision à légard de la chirurgie prophylactique, exige une collaboration étroite des généticiens et des psycho-oncologues.Les soins de support en oncologie     

The role of papillomaviruses in human cancers

This review comprehensively evaluates the influence of gene-gene, gene-environment and multiple interactions on the risk of colorectal cancer (CRC). Methods of studying these interactions and their limitations have been discussed herein. There is a need to develop biomarkers of exposure and of risk that are sensitive, specific, present in the pathway of the disease, and that have been clinically tested for routine use. The influence of inherited variation (polymorphism) in several genes has been discussed in this review; however, due to study limitations and confounders, it is difficult to conclude which ones are associated with the highest risk (either individually or in combination with environmental factors) to CRC. The majority of the sporadic cancer is believed to be due to modification of mutation risk by other genetic and/or environmental factors. Micronutrient deficiency may explain the association between low consumption of fruit/vegetables and CRC in human studies. Mitochondrial modulation by dietary factors influences the balance between cell renewal and death critical in colon mucosal homeostasis. Both genetic and epigenetic interactions are intricately dependent on each other, and collectively influence the process of colorectal tumorigenesis. The genetic and environmental interactions present a good prospect and a challenge for prevention strategies for CRC because they support the view that this highly prevalent cancer is preventable.     

Antifungal combination therapy in localized candidosis

A mouse model of localized candidosis in air-filled subcutaneous cysts imitating thrush has been developed. We have now tested various antifungal combinations in this animal model. Flucytosine (5-FC) + amphotericin B (Amph B) showed the highest efficacy, a clear additive or even synergistic effect was seen. The combination of 5-FC + imidazole or triazole derivative was less efficacious, an additive effect was rare. The combination of 5-FC + Amph B was also tested against Candida albicans strains showing various degrees of 5-FC-resistance. A significant reduction in 5-FC-resistant mutants was seen after the treatment with the combination.     

Les génériques en cancérologie: à molécule identique, médicaments identiques? Les biosimilaires, des super-génériques?

Résumé: Les biosimilaires vont bientôt voir leur apparition en Europe. Comment un laboratoire peut-il aborder le développement de son dossier dAMM? Quelles sont les bases légales et les recommandations officielles? Comment la similarité et/ou le caractère générique peuvent-ils être démontrés? Les règles sont-elles identiques à celles des produits chimiques conventionnels pour lesquels, notamment en cancérologie, il existe des médicaments génériques? Comment faire pour que la sécurité et lefficacité des médicaments biosimilaires soient assurées pour les patients?     

Dermatomycosis in Dogs

During the routine examination of dogs for cutaneous lesions, 205 dogs were screened for fungi other than dermatophytes. Twenty-two dogs (10.8%) revealed the presence of non-dermatophytic fungi suspicious for representing the etiologic agents of the skin lesions. The fungi isolated were Alternaria sp. (2.9%), Penicillium sp. (2.4%), Aspergillus fumigatus (2.0%), Mucor sp. (1.5%), Cladosporium sp. (1.5%) and Fusarium sp. (0.5%). No dermatophyte was isolated in association with these fungi. The incidence of these infections was found to be greater in warm and humid climate.     

PSA-Test zur Früherkennung des Prostatakarzinoms

Zusammenfassung Prostatakrebs ist hierzulande seit einigen Jahren die häufigste Krebserkrankung bei Männern. Da über die Ätiologie wenig gesichertes Wissen vorliegt und daher kaum Möglichkeiten zur primären Prävention bestehen, konzentrieren sich die Anstrengungen auf die Suche nach wirksamen Verfahren zur sekundären Prävention. Hierbei gilt die Verwendung des PSA-Tests zur Früherkennung des Prostatakarzinoms als derzeit aussichtsreichstes Verfahren. Bevor ein neues Früherkennungsverfahren zur breiten Anwendung empfohlen oder in das gesetzliche Früherkennungsprogramm aufgenommen wird, muss jedoch seine Wirksamkeit in hierfür geeigneten wissenschaftlichen Untersuchungen nachgewiesen werden. Bis jetzt gibt es bereits eine ganze Reihe epidemiologischer Studien zur Effektivität des PSA-Screenings, doch konnte ein Wirksamkeitsnachweis bisher nicht erbracht werden. Zwei große randomisierte Studien in Europa und den USA lassen für die Jahre 2005–08 erste Ergebnisse erwarten. Da epidemiologische Arbeiten belegen, dass durch PSA-Screening eine nicht unerhebliche Überdiagnostik und Übertherapie eintritt, d. h. Schaden angerichtet werden kann, ist das Ergebnis der genannten randomisierten Studien vor weitergehenden Entscheidungen unbedingt abzuwarten. Bis dahin sollte von der Anwendung des PSA-Tests zur Prostatakrebsfrüherkennung unmissverständlich abgeraten werden. Da für den Test bereits ausgiebig Werbung betrieben wurde, kommt einer gründlichen ärztlichen Aufklärung von an dem Test interessierten Personen eine Schlüsselrolle zu.     

Cancer immunotherapy

Unprecedented progress has seen made in the last decade in the field of cancer immunotherapy. The recent approval of nivolumab （Opdivo）, the first anti-programmed cell death-1 （PD-1） antibody, for metastatic melanoma in Japan, marked a milestone in the rapidly advancing field of cancer immunotherapy. Nivolumab together with ipilimumab （Yervoy）, the anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 （CTLA-4） antibody, are the first 2 drugs in the class of ＂immune checkpoint inhibitors＂ that have delivered impressive responses in patients with metastatic melanoma and renal cell cancer （RCC） as well as a variety of solid tumors.