人血栓调节蛋白基因编码片段的克隆及在真核细胞中的表达

目的 构建人血栓调节蛋白（hTM）基因真核表达质粒，并导人两种真核细胞[非洲绿猴肾母细胞（COS-7细胞）和脐静脉内皮细胞（HUVECs）]中表达，为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法采用PCR法扩增hTM基因的表达片段，HindⅢ＋EcoR Ⅰ酶切后与pcDNA3．1（＋）／neo质粒连接成pcDNA3．1／hTM。经鉴定确认后，由阳离子脂质体包裹转染COS-7细胞及HUVECs，RT-PCR和免疫组化法分别检测转染后细胞hTM的mRNA及蛋白的表达。结果双酶切及测序鉴定均证实hTM基因表达片段被成功克隆，pcDNA3．1／hTM经脂质体介导能有效地转染COS-7细胞和HUVECVs。结论成功构建pcDNA3．1／hTM重组质粒，并且能在两种真核细胞中高效表达，为进一步的基因治疗和对TM抗凝机理研究提供了物质基础。     

人凝血酶调节蛋白基因对兔动脉壁的转染

目的 探讨注射加压转染的方法对兔动脉壁进行人凝血酶调节蛋白(human thrombomodulin, hTM)基因转染的可行性.方法 健康新西兰大白兔84只,应用抽签法随机分为3组: pcDNA3.1/hTM质粒组(n=28),pcDNA3.1(+)/neo质粒组(n=28)和未转染组(n=28),通过基因转染并建立动脉损伤-阻滞模型,于术后3、7、14和28 d分别检测hTM mRNA和蛋白在动脉壁的表达.结果 17只实验动物在手术当天至术后3 d内意外死亡.pcDNA3.1/hTM质粒组各时间点的hTM mRNA表达都明显高于pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组(P＜0.01);pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组组内和组间每个时间点的hTM mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05).hTM蛋白在各组中均有表达,主要位于动脉内腔面;pcDNA3.1/hTM质粒组各时间点的hTM蛋白表达明显高于pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组(P＜0.05);pcDNA3.1(+)/neo质粒组和未转染组的hTM蛋白表达在各个时间点都相对恒定,组内和组间比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 用动脉腔内加压法可以有效地对活体动物的动脉壁进行基因转染.     

RhoC基因对肝癌细胞促血管生长因子表达的影响

目的:观察RhoC基因对肝癌HepG2细胞表达促血管生长因子（VEGF，bFGF）的影响。 方法:将pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1转染HepG2细胞，用RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞的RhoC mRNA及RhoC蛋白表达情况;RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞VEGF和bFGFmRNA及蛋白的表达。将转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1的HepG2细胞接种裸鼠，观察肿瘤的成瘤率。结果:与转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒的细胞表达RhoC mRNA及RhoC 蛋白增强，其表达VEGF和bFGFmRNA及蛋白明显增强（P＜0.01）;重组质粒转染组成瘤率高于空载体组。结论:RhoC表达可促进HepG2细胞表达血管内皮生成因子。RhoC可促进肝癌细胞分泌促血管生长因子，可能是促进肝癌侵袭、转移的机制之一。     

pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建标记有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(hTIMP-1)真核表达质粒pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP,并通过转染大鼠血管平滑肌细胞(SMCs)验证hTIMP-1的表达.方法 将hTIMP-1及编码EGFP的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列通过扩增、酶切、插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达质粒;应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入SMCs(pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组).应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测hTIMP-1的表达情况;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性.用空质粒pcDNA3.1转染SMCs(空质粒pcDNA3.1转染组)和未转染质粒的SMCs(未转染组)作为对照.结果 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组重组质粒转染SMCs后,SMCs生长受到抑制;转染24 h后在荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,SMCs出现646 bp目的基因;Western blotting检测显示,在转染后的血管SMCs中有hTIMP-1表达;明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2、MMP-9活性降低;与空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 TIMP-1真核表达质粒的构建和在血管SMCs中的表达,为TIMP-1基因治疗的研究奠定了基础.     

C型利钠肽对血管内皮细胞株增能力的影响

目的 了解C型利钠肽（CNP）对血管内皮细胞增殖能力的影响。方法 将所构建的含人CNP（hCNP）的重组质粒pcDNA3．1（＋）在聚乙烯亚胺介导下转染人脐静脉血管内皮细胞株。通过反转录-聚合酶链反应、免疫组织化学和蛋白质印迹法检测该质粒的表达，用噻唑蓝法检测该质粒的表达产物对人脐静脉血管内皮细胞株增殖能力的影响。同法转染下列物质作对照：pcDNA3．1（＋）（阴性对照）、增强型绿色荧光蛋白质粒（阳性对照，只用于检测转染率）、磷酸盐缓冲液（空白对照）。结果pcDNA3，1（＋）转染48h后人脐静脉血管内皮细胞株的增殖能力为0．164±0．012；与其比较，含hCNP的pcDNA3．1（＋）在血管内皮细胞中能高效表达，可使细胞增殖能力达0．3014±0．096（P〈0．05）。结论 CNP具有促进血管内皮细胞增殖的生物学活性。以聚乙烯亚胺介导转染质粒、检测CNP在血管内皮细胞中的表达及测定被转染细胞增殖活性等方法的建立，为开展CNP基因治疗提供了物质基础和实验依据。     

miR-584-5p通过下调MMP-14抑制乳腺癌细胞生物学行为

目的 探讨微小RNA-584-5p(miR-584-5p)对乳腺癌细胞生物学行为（增殖、迁移和侵袭）的影响及其作用机制。方法 选择人正常乳腺上皮细胞MCF10A及乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3和MCF-7；取对数生长期的MCF-7细胞，应用Lipofectamine TM 2000转染试剂盒对其进行转染，并分为7组：空白组（未转染的MCF-7细胞）、模拟物-阴性对照组（mimic-negative control,mimic-NC,mimic-NC组；转染mimic-NC）、miR-584-5p mimic组（转染miR-584-5p mimic）、pcDNA组[转染过表达基质金属蛋白酶-14(MMP-14)的pcDNA3.1质粒阴性对照（pcDNA3.1）]、MMP-14组[转染过表达MMP-14的pcDNA3.1质粒（pcDNA3.1-MMP-14）]、mimicNC+MMP-14组（共转染mimic-NC和pcDNA3.1-MMP-14）及miR-584-5p mimic+MMP-14组（共转染miR-584-5p mimic和pcDNA3.1-MMP-14）。荧...     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

乙型肝炎病毒包膜蛋白诱导肝癌细胞系内质网应激的研究

目的探讨乙型肝炎病毒前-S缺失和野生型外膜大蛋白（LHBs）诱导内质网应激反应。 方法运用脂质体转染技术将pcDNA3.1-S、pcDNA3.1-L、pcDNA3.1-L△30和pcDNA3.1-L△182等真核表达质粒转染至Huh7细胞,并应用qRT-PCR和Western blot方法检测转染细胞前-S1、前-S2、HBsAg和GRP78的mRNA和蛋白表达水平。 结果转染HBV包膜蛋白各组的HBsAg蛋白相对表达量（分别为0.92、0.83、0.91、1.75、2.53和2.06）高于空白对照（0.00）和pcDNA3.1（+）转染组（0.00）（F = 247.38、P = 0.000）;转染HBV包膜蛋白各组的GRP78的蛋白相对表达量（分别为1.4、1.47、1.55、1.75、1.8和1.9）高于空白对照（1.18）和pcDNA3.1(+)转染组（1.23）（F = 11.623、P = 0.000）;且GRP78蛋白相对表达量与前-S1、前-S2抗原和HBsAg表达量呈正相关（相关系数r分别为0.884、0.728和0.816）。 结论前-S缺失型/野生型LHBs及HBsAg均能诱导Huh7细胞发生内质网应激反应,提示其可能参与肝癌发生。     

SH2-B对结肠癌HT-29细胞增殖的影响

目的：探讨SH2-B对结肠癌HT-29细胞周期演进和细胞增殖的影响。
方法：免疫荧光筛选SH2-B低表达结肠癌细胞（HT-29）。用LipofectAMINE2000将pcDNA3.1-SH2-B质粒转染至HT-29细胞（转染组），并设空载体转染组和未转染组作为对照。Western-blotting分析SH2-B转染后SH2-B的表达，MTT法分析SH2-B转染后HT-29细胞的增殖，流式细胞术分析SH2-B转染后HT-29细胞周期变化。
结果：将pcDNA3.1-SH2-B质粒转染至HT-29细胞后可获得SH2-B的有效表达。转染SH2-B 后HT-29细胞增殖显著增强（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果显示，转染SH2-B组S期细胞显著高于未转染组和空载体组（P＜0.05）。
结论：SH2-B促进结肠癌HT-29细胞增殖和细胞周期演进。

     

外源性CC10基因表达对肝癌细胞增殖、 凋亡、迁移和侵袭的影响

目的 探究外源性Clara细胞分泌蛋白10（CC10）的基因表达对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和 侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 采用RT-qPCR和Western blotting检测人正常肝细胞LO2和 肝癌细胞HepG2、Hep3B中CC10的内源表达水平;将HepG2细胞系分为pcDNA 3.1组和pcDNA 3.1-CC10 组,用LipofectionTM分别转染pcDNA 3.1空载体质粒和重组质粒pcDNA 3.1-CC10。用CCK-8法、TUNEL 法和Transwell小室实验分别检测两组细胞增殖、凋亡情况及迁移、侵袭能力。采用RT-qPCR和Western blotting检测两组细胞中CC10和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达水平。结果 与正常肝细胞LO2相 比,CC10在肝癌细胞HepG2、Hep3B中呈明显低表达（P<0.05）;转染 pcDNA 3.1-CC10后的HepG2细胞内 CC10 mRNA和蛋白水平均显著增高（P<0.05）。与 pcDNA 3.1组相比,pcDNA 3.1-CC10组细胞活力受到抑 制,细胞活力以时间依赖性方式降低（P<0.05）,细胞迁移和侵袭实验中的过膜细胞数均低于pcDNA 3.1组 （P<0.05）,细胞凋亡率高于pcDNA 3.1组（P<0.05）。同时,Cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低 （P<0.05）。 结论? 外源性CC10基因表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,其机制可能与 下调Cyclin D1表达有关。     

hVEGF165/pcDNA3.1在小鼠心肌细胞中的表达

目的观察重组质粒人血管内皮生长因子165基因与质粒载体pcDNA3．1的重组体（hVEGF165／pcDNA3．1）在心肌细胞中的表达，为冠心病的基因治疗和细胞移植治疗研究奠定基础。方法体外培养小鼠心肌细胞，脂质体介导hVEGF165／pcDNA3．1转染心肌细胞，用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、细胞免疫化学方法和免疫印迹法（Western blotting）检测其在心肌细胞中的瞬时表达。结果RT—PCR扩增得到与hVEGF165大小一致的目的条带，细胞免疫化学法检测到心肌细胞胞质中hVEGF蛋白，Western blotting在培养的细胞上清液中检测到hVEGF蛋白。结论构建的重组质粒hVEGF165／pcDNA3．1能在体外培养的小鼠心肌细胞中表达，可用于冠心病的基因和细胞移植治疗研究。     

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

bFGF基因修饰雪旺细胞表达的实验研究

目的 利用基因工程技术将外源bFGF基因以质粒pcDNA3.1为载体导入大鼠雪旺细胞,观察外源bFGF基因在雪旺细胞中的表达水平.方法 通过预变性大鼠坐骨神经、混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;将真核表达质粒pcDNA3.1及外源bFGF基因片段双酶切,酶切片段回收后重组bFGF-pcDNA3.1质粒;通过脂质体转染法将pcDNA3.1-bFGF质粒导入雪旺细胞,用EIASA及RT-PCR方法分别从蛋白质水平及mRNA水平检测bFGF的表达情况.结果 经外源bFGF基因修饰的大鼠雪旺细胞,bFGF的表达水平极大提高(H=126.835,v=2,P=0.000),并且相对持续、稳定.结论 bFGF基因修饰的雪旺细胞能持续稳定高水平地表达分泌bFGF,将bFGF基因与雪旺细胞移植载体相结合治疗脊髓损伤具有独特的优势,为下一步bFGF基因修饰细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究奠定了基础.     

外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

转染血管内皮生长因子基因的小鼠NIH3T3细胞移植促进皮瓣早期血运重建的研究

目的探讨转染血管内皮生长因子（VEGF）基因的小鼠NIH3T3细胞移植对缺血皮瓣的血管新生和皮瓣存活率的影响。方法体外PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染小鼠NIH3T3细胞,免疫组化方法检测小鼠NIH3T3细胞体外表达VEGF的情况,CM-DiI标记小鼠NIH3T3细胞。将小鼠随机分为3组：A组[PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的NIH3T3细胞移植]、B组（单纯NIH3T3细胞移植）、C组（单纯DMEM培养基注射）。每只小鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基,注射后酶联免疫吸附（ELISA）法连续检测大鼠血浆VEGF浓度,注射后第4天掀起一个蒂在尾侧的4．0cm×1．5cm的随意皮瓣。术后第7天分别观察皮瓣的存活率、血流灌注、皮瓣毛细血管密度、NIH3T3细胞在皮瓣内的分布和存活情况。结果转染VEGF165基因的小鼠NIH3T3细胞体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A组的皮瓣存活率、毛细血管密度、血流灌注比值均显著高于另外两组（P〈0．05）。结论转染VEGF基因的小鼠NIH3T3细胞皮下移植可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

雄激素和雌激素受体与食管癌的关系

目的 通过测定食管癌组织中雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）的含量,探讨食管癌生物学行为与AR和ER的关系。方法 应用放射配体结合分析法定量测定31例食管癌患者癌组织中AR和ER的含量,并与正常食管黏膜组织作对照。结果 与正常食管组织比较,食管癌组织中存在较多的AR和ER,其含量与患者性别、分化程度、浸润程度、有无淋巴结转移有关（P＜0．05）,而与患者年龄、肿瘤的部位无明显关系（P＞0．05）。结论 AR和ER含量与食管癌生物学行为关系密切,可能为食管癌的防治提供新的方法,并作为评价食管癌患者预后的新指标。     

PcDNA3.1(-)-edPSMA载体的构建及其稳转鉴定

目的 构建人前列腺特异性膜抗原胞外区(edPSMA)真核表达质粒,并建立稳定表达edPSMA的小鼠前列腺癌(RM-1-edPSMA)的细胞株.方法 构建PcDNA 3.1(-)-edPSMA真核表达载体并测序,脂质体转染法分别将PcDNA 3.1(-)-edPSMA质粒和PcDNA3.1(-)空载质粒转染至RM-1细胞,G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测edPSMA蛋门的表达.结果 质粒经酶切测序,结果与Gene Bank序列进行Blast比对分析,同源性为99.7%,RT-PCR和Western blot均证明转染了 PcDNA 3.1(-)-edPS-MA质粒的RM-1细胞表达edPSMA.结论 成功构建了PcDNA 3.1(-)-edPSMA质粒,并建立了稳定表达edPSMA的细胞株.     

SD大鼠MSX-2基因真核表达载体的构建与功能鉴定

目的 构建SD大鼠颅颌面发育相关基因MSX-2与PcDNA 3.1融合的高效真核表达载体,为研究MSX-2基因的功能奠定基础.方法 根据SD大鼠MSX-2基因的核苷酸序列,设计并合成引物,采用PCR技术,扩增编码MSX-2基因,TA克隆到PMD18-T载体上,再亚克隆到真核表达载体PcDNA 3.1的BamHI和Xhol位点.对该重组体进行酶切鉴定,以及测序验证.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot检测重组MSX-2基因的RNA和蛋白表达情况.结果 重组真核表达载体PcDNA3.1-MSX-2经PCR扩增、酶切鉴定均显示有476bp左右的特异性基因片断,证明MSX-2基因正向插入真核表达载体中;碱基序列的测定证明重组质粒中含有SD大鼠的MSX-2基因序列.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot可检测到重组MSX-2基因的mRNA和蛋白的特异表达.结论 成功构建SD大鼠MSX-2基因的高效真核表达载体,为进一步研究MSX-2基因的功能及基因治疗奠定了基础.