日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体的构建表达与初步鉴定

目的构建和表达日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体,初步鉴定表达产物的活性。方法用overlap PCR法扩增双链抗体基因VH-GGGGS—VL将双链抗体基因重组入原核表达载体pBAD／gⅢ。表达质粒转化E．coli TOP10F’,左旋阿拉伯糖诱导表达。对表达产物进行分离纯化,ELISA检测纯化蛋白与血吸虫病人血清抗体的结合活性。结果测序证实双链抗体基因正确,构建了双链抗体的原核表达系统,双链抗体在细菌超声上清和沉淀内均有表达,分子量约为34kD。纯化产物经ELISA鉴定,结果表明NP30单特异性双链抗体可与血吸虫病人血清抗体特异性结合。结论构建和表达的日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体具有与亲本单抗相同的结合活性。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链(CDR3)_6基因的构建表达及初步鉴定

目的设计、构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链(H链)CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6,并对表达产物进行初步鉴定.方法克隆NP30 H链(CDR3)6基因,导入PET-28(a)载体并在E.coli BL21中表达;表达产物经纯化后用ELISA方法测定活性.结果(CDR3)6基因被成功构建、表达,表达产物经ELISA检测证实其可与抗NP30抗体NP48及日本血吸虫病人血清反应.结论(CDR3)6部分保留了抗独特型抗体表位的亲和性和特异性.     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体基因的构建和表达

目的　构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体 (scFv)基因。　方法　通过PCR方法体外扩增并经测序验证的重链、轻链可变区 (VH、VL)基因先后重组入原核表达质粒 pTHA90相应的位点上 ,中间通过一连接肽 (Gly4 Ser) 3基因连接构建成单链抗体基因 (scFv) ,连接产物转化相应受体菌Top1 0 ,提取质粒 ,酶切鉴定重组克隆。表达产物经ELISA方法测定活性。　结果　重组克隆经酶切鉴定可见预期大小的片段 ,表明重组成功。表达产物经ELISA检测 ,OD4 92 值为 1 .0 6 ,高于阴性对照 3倍以上 ,证实具有与相应抗原结合的能力。　结论　成功地构建了scFv基因 ,且其表达产物保留了抗体的亲和性和特异性     

抗TNF-α蛋白Fab抗体的制备和鉴定

目的制备人源性抗肿瘤坏死因子（TNF）-α蛋白的可溶性Fab抗体。方法用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况,ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体;ELISA筛选出的2株抗体（TA-04、TA-13）具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应。结论成功制备并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体。     

重组多肽酶联免疫吸附法检测抗Scl-70抗体的初步应用

目的制备人Scl-70抗原207～765位氨基酸片段融合蛋白作为自身抗原,探讨ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性和特异性。方法构建编码Scl-70抗原第207至第765位氨基酸片段的重组体,在宿主菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后,免疫印迹法鉴定抗原性,ELISA检测北京协和医院免疫科血清库中系统性硬化（SSc）及部分其他结缔组织病患者血清抗Scl-70抗体。结果重组融合蛋白在宿主菌中获得可溶性表达,免疫印迹法鉴定表明其能与标准抗Scl-70抗体阳性血清反应,而与正常血清、其他抗血清无反应。在36份SSc患者血清中,天然抗原免疫双扩散（DID）法共检出的6份阳性血清用重组多肽ELISA检测有5份呈阳性,30份经天然抗原DID法检测为阴性的血清用重组多肽ELISA检测有3份呈阳性;20份其他结缔组织病患者血清用重组多肽ELISA检测均为阴性。结论重组的207—765位氨基酸片段是Scl-70抗原的主要抗原表位区域,以重组多肽为基质ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性较高,为进一步研究抗体水平与临床病情变化的相关性奠定了基础。     

抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建 表达及生物学活性鉴定

目的构建抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核融合表达载体,并对其表达产物进行生物学活性鉴定。方法应用PCR方法体外扩增NP11-4VH、VL、scFv和PE38KDEL基因,经测序后将scFv及PE38KDEL基因通过限制性内切酶双酶切及连接反应,构建原核表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,转化E.coliTop10F′,L-阿拉伯糖诱导表达,表达产物经Western blot及ELISA鉴定其活性。结果构建了重组免疫毒素表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约为70kD;经变性、复性后的重组免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性。结论构建及表达了抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素,为血吸虫病治疗提供了一条新思路。     

抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定

目的将已筛选出的抗汉坦病毒核衣壳蛋白（NP）抗原单链抗体基因克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-scFv。方法提取含抗NP抗原单链抗体基因的T7噬菌体DNA,此为模板,PCR扩增单链抗体基因,BamHI和SalⅠ双酶切,经连接酶与BamHⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pGEX-6p-1连接;重组DNA转化入宿主菌E．coli BL-21（DE3）,琼脂糖凝胶电泳初筛选阳性重组质粒,并用PCR法、双酶切法及DNA测序鉴定。结果重组质粒pGEX-6P-1-scFv经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,片段大小分别为5000bp和750bp,与预期值一致;重组质粒PCR产物大小为750bp,与预期值一致;测定重组质粒序列,并与scFv序列比较,结果相一致。抗NP单链抗体基因序列克隆人表达载体pGEX-6p-1。结论成功构建了含抗汉坦病毒NP抗原单链抗体基因的重组原核表达质粒pGEX-6P-1-SCFv。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

人抗地高辛单链抗体在大肠杆菌的表达

目的：研究人抗地高辛（Dig）单链抗体（ADAscFv）在大肠杆菌（E．coli）的表达及包涵体变性和复性条件。方法：（1）用PCR扩增人ADAscFv基因，重组于克隆载体pGEM—T，NdeI＋Sail消化回收目的基因，插入pT7．7载体构建表达载体pT—ADAscFv，转化E．coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，SDSPAGE分析目的蛋白的表达情况，筛选高表达克隆；（2）提取纯化包涵体，SDS-PAGE分析其纯度，采用不同的方法及条件进行变性及复性，ELISA检测活性。结果：（1）SDS＋PAGE显示，含有重组质粒pT-ADAscFv的E．coli菌株BL21（DE3）的表达产物中有一条约30kD的条带，其分子量与预期值相符，提取纯化的包涵体的纯度较高；（2）ELISA显示，透析复性法和稀释复性法均可使其复性。结论成功地构建了人ADAscFv表达载体，实现了其在E．coli的表达并对其包涵体变性、复性条件进行了研究，为制备适于临床上诊断及治疗Dig中毒的人源性单抗奠定了基础。     

抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达

目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组B抗原（r-AgB)的人源单链可变区抗体（SCfv)。为细粒棘球蚴B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组纯化的细粒棘球蚴B抗原为固相抗原，经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗r-AgB的ScFv基因片段的阳性克隆，提取质粒，经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后，亚克隆到pCANTAB5E载体上，转化大肠杆菌XL1-Blue，经IPTG诱导，表达可溶性ScFv。结果 筛选得到的ScFv片段基因为768bp，经SDS-PAGE鉴定，在大肠杆菌XL1-Blue中表达的ScFv分子质量约28ku，经过ELISA和Western-Blot检测，该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性，结论 细粒棘球蚴重组B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功，为今后包虫病人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因的克隆及序列分析

[目的]分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区 (VL)基因并测定其序列。 [方法 ]根据鼠免疫球蛋白轻链可变区基因FR1和FR4序列的保守性 ,化学合成用于体外扩增Ig轻链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板 ,扩增VL 基因 ,将其克隆入 pUC19载体 ,重组子用Sanger的双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与GenBank中已发表的抗体序列比较。 [结果 ]VL 基因全长 318bp ,属鼠免疫球蛋白κ轻链第IV亚类 ,由种系基因V与Jκ4 重排而来。该VL 基因序列已被GenBank收录 (accessionNo AF2 0 6 72 0 )。 [结论 ]该VL 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因。     

用抗日本血吸虫虫卵单克隆抗体NP28-5B检测循环抗原的研究

本研究使用杂交瘤技术制备鼠抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)单克隆抗体NP28-5B,其同型鉴定为IgGl,针对的靶抗原分子量为140kD。将酶标记单抗NP28-5B进行Dot-ELISA直接法检测急性患者血清100份和慢性血吸虫病患者血清200份中循环抗原,阳性率分别为96％和98％,检测正常人血清200份,仅3例假阳性(1.5％)。用双盲法检测血吸虫病流行区江西矶山岛居民血清339份,其中粪检阳性血清114份,阳性率为89.47％,粪检阴性血清225份,阳性率为69.33％,研究证明NP28-5B具有高度诊断潜能。     

日本血吸虫分泌蛋白和外膜蛋白的原核表达与鉴定

目的 目的 原核表达和鉴定含有编码日本血吸虫分泌蛋白、 外膜蛋白基因的重组质粒, 为高通量筛选日本血吸虫病 疫苗或诊断抗原奠定基础。方法 方法 将前期构建的28个含有分泌蛋白、 外膜蛋白编码基因序列的pET32 （+） 重组质粒通过 化学法转到大肠杆菌 （E. coli） BL21 （DE3） 菌株中进行培养, 加入异丙基?β?D?硫代半乳糖苷 （IPTG） 进行诱导表达。对诱 导表达后的细菌进行超声破壁, 以12% SDS?PAGE分别对菌液、 上清及沉淀进行检测, 判断目的蛋白的大小和表达分布 情况。利用蛋白芯片结合抗His标签荧光抗体对重组融合蛋白表达情况做进一步鉴定。结果 结果 在IPTG终浓度0.1 mmol/L、 37 ℃、 200 r/min和4 h的诱导条件下, 含有编码分泌蛋白、 外膜蛋白序列的重组质粒能够在E. coli BL21 （DE3） 中高效表 达。SDS?PAGE显示28个融合蛋白具有不同程度的表达, 其中2个分布在上清中, 26个分布在沉淀中, 条带大小与预测 大小一致。蛋白芯片成功检测到His抗体荧光信号, 进一步证实了目的蛋白的表达情况。结论 结论 利用E. coli成功表达了 一批编码日本血吸虫分泌蛋白、 外膜蛋白的融合蛋白, 为后续疫苗和免疫诊断研究奠定了基础。     

抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达

目的　用基因工程抗体技术构建抗日本血吸虫膜蛋白特异的单链抗体。　方法　用抗体框架区的通用引物 PCR扩增抗日本血吸虫膜蛋白特异性单克隆抗体 NP11- 4的 VH 及 VL 基因 ,测序分析其核苷酸序列。用VH 和 VL 基因在 p THA90质粒载体中构建成单链抗体基因并诱导表达。　结果　扩增获得 NP11- 4的 VH 和 VL基因 ,经测序分析确定为新发现的抗体可变区序列 ,构建成排列顺序为 VH- linker- VL 的单链抗体基因 ,经诱导表达出与硫氧环蛋白融合的单链抗体 ,大小约为 36 .2 k Da,以包涵体形式存在。　结论　成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体。     

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。