机采血小板细菌16s rRNA基因检测的临床研究

目的 探讨快速、可靠的检测机采血小板(PLT)细菌污染的新方法.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增1 308份献血员机采PLT 16s rRNA基因,以乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV DNA)、白假丝酵母菌和人类基因组DNA为对照,检测该方法的特异性;采用10倍倍比稀释法进行该方法的敏感性检测.结果 检测1308份献血员机采PLT,其中7份16s rRNA基因为阳性,阳性率为0.54%(7/1 308).而与HBV DNA、白假丝酵母菌和人基因组DNA无交叉反应;PCR最低能检测1.5 × 10~4cfu/L大肠埃希菌.结论 献血员机采PLT板细菌污染的阳性率为0.54%;利用PCR检测献血员机采PLT细菌16s rRNA基因的方法具有特异性、快速性和敏感性高等特点.     

16S rDNA检测在临床细菌检验中的应用

目的根据细菌16S rDNA的高度保守性,设计合成所有细菌的通用引物,建立快速检测细菌的方法。方法应用PCR方法检测细菌16S rDNA基因。同时对白假丝酵母菌、人白细胞DNA和HBV-DNA阳性病人血清同法检测。结果所有检测细菌均出现特异性条带,而白假丝酵母菌、人白细胞DNA和HBV-DNA阳性病人血清阴性。结论该法快速、特异、敏感。一个样品中能同时检测多种细菌,可为实验室初步判断是否存在细菌感染提供客观依据。     

16SrRNA基因在诊断慢性非细菌性前列腺炎中的应用

目的探索快速可靠的检测慢性非细菌性前列腺炎细菌感染的新方法。方法应用PCR方法检测70例慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液和尿道拭子中细菌16SrRNA基因。用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因，以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌为对照，检测该方法的特异性；采用倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果细菌16SrRNA基因的检出率在前列腺液中和尿道拭子中分别为54．3％和7．1％，差异有显著意义（P＜0．01）。对所测细菌株均获得920bp扩增产物，而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌无交叉反应；PCR最低能检测1．5^＊10^6／L大肠杆菌DNA。结论慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液中有细菌16SrRNA基因的检出。其病因可能与细菌感染有关。PCR具有快速，特异性和敏感性高的特点。     

白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11基因分析

目的 研究白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11的变异情况.方法 将93例诊断为真菌性阴道炎的患者的阴道分泌物标本进行真菌培养,筛选白假丝酵母菌菌株,利用纸片扩散法进行氟康唑、酮康唑、咪康唑药敏试验,用加热裂解法提取菌株DNA,扩增ERG11基因,扩增后的PCR产物进行双向测序,测序结果与GenBank中的标准序列（SC5314）比较分析.结果 93例均培养出假丝酵母菌,包括60株白假丝酵母菌,19株热带假丝酵母菌,9株克柔假丝酵母菌和5株光滑假丝酵母菌;白假丝酵母菌对氟康唑、酮康唑、咪康唑耐药率分别为13.33%,20.00％和51.67％;对白假丝酵母菌的ERG11基因测序发现存在25个碱基突变位点,其中13个同义突变,12个错义突变,其中有6个是新变异：V36F,V51L,T123I,E194K,Y257H和K344N.结论 耐吡咯类药物白假丝酵母菌ERG11基因有多个错义突变位点,其中某些位点突变导致的氨基酸变异可能与其耐药性产生有关.     

白假丝酵母临床分离株基因分型与药敏分析

目的分析上海交通大学医学院附属瑞金医院白假丝酵母的基因分型情况以及不同基因型白假丝酵母的药敏结果。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增白假丝酵母25S核糖体DNA基因的内含子区,可转座Ⅰ型内含子插入片段的数目及大小的不同使得扩增产物不同,根据产物片段大小和数目分型。采用微量稀释法分析白假丝酵母抗真菌药物敏感性。结果171株白假丝酵母分为3型:A型93株,B型47株,C型31株。B型、C型白假丝酵母对唑类抗真菌药物的耐药率显著高于A型菌株,对氟胞嘧啶的耐药率低于A型菌株。结论白假丝酵母的PCR分型方法简便、快速、重复性好、特异性强;不同型别的白假丝酵母耐药谱有差异,对治疗中抗真菌药物的选择有一定的指导意义。     

白假丝酵母临床分离株基因分型与药敏分析

目的分析上海交通大学医学院附属瑞金医院白假丝酵母的基因分型情况以及不同基因型白假丝酵母的药敏结果。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增白假丝酵母25S核糖体DNA基因的内含子区，可转座Ⅰ型内含子插入片段的数目及大小的不同使得扩增产物不同，根据产物片段大小和数目分型。采用微量稀释法分析白假丝酵母抗真菌药物敏感性。结果171株白假丝酵母分为3型：A型93株，B型47株，C型31株。B型、C型白假丝酵母对唑类抗真菌药物的耐药率显著高于A型菌株，对氟胞嘧啶的耐药率低于A型菌株。结论白假丝酵母的PCR分型方法简便、快速、重复性好、特异性强；不同型别的白假丝酵母耐药谱有差异，对治疗中抗真菌药物的选择有一定的指导意义。     

白假丝酵母菌随机扩增多态DNA分型及其流行趋势分析

目的:探讨采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析临床分离的白假丝酵母菌分型结果及其流行趋势。方法:选用不同的引物、Mg~(2+)、模板浓度、Taq聚合酶用量等,获得一优化的反应体系以对白假丝酵母菌进行RAPD分型。结果:经优化的RAPD方法能将105株白假丝酵母菌菌株分成8个基因型。结论:结果显示该方法的可分型性、灵敏度、重复性及特异度均较良好,可对白假丝酵母菌快速、简便地进行基因分型,可广泛应用于流行病学调查与研究。     

白色假丝酵母菌ERG11基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系

目的探讨白色假丝酵母菌ERG11基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系。方法纸片扩散法初步筛选临床分离的耐唑类抗真菌药物的白色假丝酵母菌,测定初筛耐药株对氟康唑和伊曲康唑的最低抑菌浓度,随机选择10株白色假丝酵母耐药株,提取基因组DNA。利用DNASTAR软件辅助设计3对PCR引物,以提取的目的 DNA为模板,分别从前(P1)、中(P2)、后(P3)3段扩增ERG11基因全序列。扩增后的PCR产物经纯化后测序,将测序结果与GenBank中已知标准序列(X13296)进行比较分析。结果电泳结果显示,获得的3段PCR产物大小与预期结果一致。测序结果显示成功获得10株白色假丝酵母菌ERG11全基因序列。与GenBank中标准株序列(X13296)比较,耐药株均存在同义突变和错义突变,共27个碱基突变位点。15个位点是错义突变,其中F126LI、166N、H183Q、V437I、S453F和N490K为新发现的突变位点。结论耐唑类抗真菌药物的白色假丝酵母菌ERG11基因有多个发生错义突变的位点,且为多点突变,可能与其耐药有关。     

白假丝酵母荧光定量PCR鉴定方法的建立

目的真菌感染发病率和死亡率逐年增高,亟需建立主要病原真菌快速、敏感、特异的鉴定方法,对感染的早期诊治至关重要。方法以真菌线粒体COⅡ基因为靶标,设计白假丝酵母的特异性引物,建立荧光定量PCR鉴定方法,分析其灵敏度、特异性及重复性。结果该方法检测的灵敏度可达1×102copies/μl(相当于10-7 ng/μl),熔解曲线显示具有单一峰,且仅有白假丝酵母出现扩增曲线,其他种、属真菌均未见扩增。且具有较好的重复性和稳定性。结论建立的白假丝酵母荧光定量PCR鉴定方法灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好,适于临床真菌感染微量标本的快速检测。该研究为真菌核酸快速检测试剂盒的开发奠定了基础。     

REP-PCR分型法用于白假丝酵母菌群分析

目的运用Agilent生物分析仪对临床白假丝酵母菌进行重复序列（REP）-聚合酶链反应（PCR）分型,并分析其流行趋势。方法设计REP引物,进行PCR扩增,用DL7500 Labchip芯片在Agilent 2100生物分析仪上对产物做微流电泳,获得虚拟凝胶视图,再运用GelCompareⅡ软件对其DNA指纹图谱做聚类分析。结果白假丝酵母菌菌株指纹图谱相似度较高,〉80%以上。被分析的100株临床株可分为9个基因型。结论REP-PCR的Agilent 2100同源性分析具有快速、易于操作、高重复性和高分辨率等优点,可广泛用于流行病学调查与研究。     

16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16SrRNA、16S-23SrRNA基因进行PCR扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16SrRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论16S-23SrRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

Multiplex PCR amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in water

Detection of pathogens (Legionella species) and indicator bacteria (coliform bacteria) was achieved by multiplex (simultaneous) PCR amplification of diagnostic gene sequences and by hybridization to immobilized poly-dT-tailed capture probes using a dot- or slot-blot approach. Complex manipulations of primer concentrations and staggered additions of primers were required in order to achieve equal amplification of multiple genes. Multiplex PCR amplification of two different Legionella genes, one specific for L. pneumophila (mip) and the other for the genus Legionella (5S rRNA), was achieved by staggered amplification. Multiplex PCR amplification using differing amounts of primers specific for lacZ and lamB genes permitted the detection of coliform bacteria and those associated with human faecal contamination, including the indicator bacterial species E. coli and enteric pathogens Salmonella and Shigella. Hybridization of biotin-labelled amplified DNA, in which the biotin was incorporated during PCR amplification from biotinylated-dUTP, to immobilized 400-dT-tailed capture probes permitted specific and sensitive detection of target gene sequences. The sensitivity of colorimetric detection achieved by PCR amplification of target DNA was at a level equivalent to 1-2 bacterial cells, which is the same level of sensitivity obtained with radioactive detection. The simultaneous amplification of several genes and hybridization to immobilized capture probes with colorimetric detection is an effective, efficient and rapid detection method for various human bacterial pathogens.     

Evaluation of an extended diagnostic PCR assay for detection and verification of the common causes of bacterial meningitis in CSF and other biological samples

A seminested polymerase chain reaction (PCR)-based diagnostic assay was evaluated for detection and verification of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Steptococcus agalactiae and Listeria monocytogenes in cerebrospinal fluid (CSF) and other biological samples. A general bacterial amplicon from the 16S rRNA gene was amplified in a first step, and species-specific regions in a second. The detection level was 4 fg DNA/reaction, corresponding to about one bacterial genome per reaction tube. Sample preparations (Dynabeads DNA DIRECT kit) were assayed from 140 bacterial strains suspended in saline. In CSF the detection level for bacteria was 10(3)CFU ml-1for N. meningitidis, H. influenzae and S. pneumoniae, 10(4)CFU ml-1for Escherichia coli and 10(5)CFU ml-1for S. agalactiae and L. monocytogenes. The detection levels for these bacteria were the same in the other tested biological samples, like blood with or without culture media. Clinical CSF samples were evaluated from 71 patients with proven bacterial meningitis, as were 61 CSF samples from individuals without bacterial meningitis. The diagnostic sensitivity of the assay in detecting bacteria in general was 0.97, and for the specific species in the clinical CSF samples 0.87-0.94. The specificity was 1.0 for detecting bacteria in general. Some cross-reactions were noted within the streptococcus group. The PCR results were verified by banding patterns of Hae III digested PCR products.     

应用实时荧光定量PCR方法检测血小板制品细菌污染

目的应用实时荧光定量PCR方法检测血小板制品中细菌的探讨。方法选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏杆菌,用改良的Chelex-100法抽提细菌基因组DNA,进行荧光定量PCR检测。并应用过滤法去除反应体系中潜在的细菌及其基因组DNA污染。结果针对16srRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,与人类淋巴细胞及病毒等的基因组无交叉反应。在金黄色葡萄球菌检测中,应用过滤法后最低含菌量组与阴性对照组Ct值有极显著差异(P<0.001)。该方法对金黄色葡萄球菌的最低检出量为0.3CFUs/PCR,与阴性对照Ct值有显著差异(P<0.01),在大肠埃希氏杆菌中该法可检测出0.1CFUs/PCR,与阴性对照Ct值有显著性差异(P<0.01)。结论改良Chelex-100法抽提细菌基因组及后续的荧光定量PCR分析用于检测血小板制品中的细菌污染,检测实验缩短到3-4h,操作简单,灵敏性高,特异性好,为在临床标本大规模检测中的应用提供理论基础和实验数据。     

16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

目的 通过16S rRNA基因序列分析快速鉴定艾伯特埃希菌。方法 以30株疑似艾伯特埃希菌为材料,使用通用引物扩增其16S rRNA基因并进行测序。获得的序列与艾伯特埃希菌型菌株LMG 20976,基因组测序菌株KF1、NBRC107761、TW07627以及其他密切相关的细菌种(大肠埃希菌、赫曼埃希菌、费格森埃希菌、志贺菌和Shimwellia blattae)的16S rRNA基因序列进行比较,并使用N-J法构建进化树来分析其相关性。结果 30株疑似艾伯特埃希菌的16S rRNA基因序列与艾伯特埃希菌参考菌株的序列相似性最高,并与其聚类为一簇,为艾伯特埃希菌。结论 16S rRNA基因测序分析可用于艾伯特埃希菌的快速鉴定。     

Rapid detection and identification of clinically important bacteria by high-resolution melting analysis after broad-range ribosomal RNA real-time PCR

BACKGROUND: Broad-range PCR provides valuable information for detecting bacterial infections. This study assesses the combined use of broad-range real-time PCR and high-resolution melting analysis for rapid detection and identification of clinically important bacteria. METHODS: We subjected 46 bacterial culture colonies representing 25 clinically important bacterial species to LightCycler real-time PCR amplification of the 16S rRNA gene in the presence of LCGreen I fluorescent dye. We performed high-resolution melting analysis of the PCR products with the HR-1 instrument and used melting profiles as molecular fingerprints for bacterial species identification. We validated this method via assessment of 54 consecutive bacteria culture colonies obtained from a clinical microbiology laboratory. RESULTS: The 16S rRNA gene of all 25 bacterial species was amplifiable by this method, with PCR product lengths of 216 or 217 bp. Of the 25 bacterial species, we identified 11 via a 1-step post-PCR high-resolution melting analysis. The remaining bacterial species were identified via the high-resolution melting plots obtained by heteroduplex formation between the PCR products of the tested and reference bacterial species or by a 2nd real-time PCR targeting a different region of the 16S rRNA gene. A high-resolution melting database and a working protocol were established for identifying these 25 bacterial species. In the validation assay, a 94% accuracy rate was achieved when the bacterial species were in the high-resolution melting database. CONCLUSIONS: This assay requires no multiplexing or hybridization probes and provides a new approach for bacterial species identification in a molecular diagnostic laboratory.     

两种念珠菌DNA探针的研制及应用

目的：制备两种念珠菌DNA探针并应用于临床诊断。方法：对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的E03基因的125bp片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的E03基因中25bp特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色敏感度，并与23株临床分离的白色念珠菌、热带念珠菌，近平滑念珠菌、克柔念珠菌、星形念珠菌及大肠埃希菌等细菌进行斑点杂交试验。结果：Dig-125bpDNA探针显色敏感度为0.01pg，仅与白色念珠菌杂交，且对临床分离株检测的结果与传统厚膜孢子鉴定法相符。Bio-25bpDNA探针显色敏感度为20pg，与白色念珠菌、近平滑念珠菌及星形念珠菌杂交。结论：Bio-25bp DNA探针可用于念珠菌初步鉴定，而Dig-125bp DNA探针可用于白色念珠菌的鉴定。     

小儿常见感染菌16S—23S rRNA基因区间的分子生物学研究

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）加限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析在细菌rDNA区间检测中的应用。方法：以16S－23S RNA基因区间为靶序列,设计引物,选择合适的内切酶,采用PCR法加RFLP法检测标准菌株及临床菌株的rDNA区间。结果：26株不同的标准菌株经PCR扩增后,分别出现一条带,两条带,三条带及多条带的不同DNA图谱,敏感性试验可检出2．5CFU的细菌,与人类基因组DNA,真菌及病毒无交叉反应,其中14种菌经一步PCR扩增即可区分,另12种菌除肺炎克雷伯氏菌与坚韧肠球菌经Hinf I或Alu I酶切后仍不能区分外,其余经其中一内切酶酶切后均能区分,32例血培养阳性标本均扩增出与相应标准菌株相一致的图谱。结论：16S－22S rRNA区间基因PCR．扩增加RFLP技术检测细菌rDNA区间,具有特异,敏感,快速,准确的特点,为细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

聚合酶链反应检测革兰阴性细菌16S rRNA

[目的]寻找诊断细菌感染病原更为敏感和有效的方法.[方法]根据细菌16S rRNA基因的高度保守性,设计合成革兰阴性细菌的共同引物,采用聚合酶链反应检测已知的革兰阴性细菌9株,革兰阳性菌4株.[结果]革兰阴性菌检测阳性率为100%,(检测革兰阳性细菌4株结果均为阴性).采用倍比稀释法检出大肠杆菌的最低浓度为4 CFU/ml.[结论]所用引物具有良好的特异性和敏感性,能达到初步鉴定细菌种属的目的.