RNA干扰抑制Nogo-A基因表达及对PC12细胞凋亡的影响

为研究Nogo-A基因沉默对细胞凋亡的影响,本文构建了靶向Nogo-A的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并经脂质体转染到培养的PC12细胞。分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测转染48h后Nogo-A mRNA及蛋白表达的变化。在转染后不同时间应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,用原位末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示:由shRNA产生的小干扰RNA(siRNA)可有效抑制PC12细胞Nogo-A基因的表达。Nogo-A siRNA处理组细胞的增殖活性增加、凋亡率明显下降。本结果提示,Nogo-A基因可能与细胞凋亡有关。     

多巴胺抑制Erastin诱导PC12细胞系铁死亡

目的探讨多巴胺在不同诱导剂导致的嗜铬细胞瘤PC12细胞死亡中的作用。方法应用RT-qPCR鉴定PC12的肿瘤特异性基因和神经相关基因的mRNA表达;通过细胞存活率评价生理浓度范围内(0~100μmol/L)不同浓度(0、6. 25、12. 5、25、50和100μmol/L)的多巴胺对PC12存活的影响,以及对药物诱导的铁死亡、凋亡和坏死的影响;流式细胞仪检测并分析PC12细胞铁死亡的发生和多巴胺保护PC12过程中PI、Annexin V和细胞周期的情况。结果 PC12表达肿瘤特异性基因和部分神经类基因。多巴胺在浓度25、50和100μmol/L时对PC12细胞有杀伤效果。生理浓度多巴胺特异性保护Erastin诱导的PC12细胞铁死亡。多巴胺能有效的降低Erastin造成的PI、Annexin V双阳性细胞上升和S期到G2/M期阻滞。结论生理浓度多巴胺对PC12有细胞毒性,并可以保护PC12抑制Erastin诱导的铁死亡。     

成纤维细胞生长因子对多巴胺神经元的保护作用

目的:探讨成纤维细胞生长因子(FGF)对多巴胺能神经元的保护作用及其机制。方法:体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞),用6-羟基多巴胺(6-OHDA)和FGF分别或共处理PC12细胞,MTT法观察6-OHDA和FGF对PC12细胞活力的影响,流式细胞术观察PC12细胞凋亡率变化,TBA法测定PC12细胞丙二醛(MDA)含量变化。结果:6-OHDA处理后PC12细胞出现浓度依赖性活力下降,FGF能够减轻PC12细胞活力下降程度,降低细胞凋亡率,同时降低PC12细胞内MDA水平。结论:FGF对多巴胺能神经元具有保护作用,其机制与降低细胞内氧化应激水平有关。     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体,PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组(DMEM完全培养液)、DMEM加入polybrene组、EN.iS(Enhance infection solution)组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率,采用Real-timePCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果病8毒滴度为1×10TU/ml,MOI为100时,PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高,转染试剂polybrene对转染效率无明显影响,沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。     

肿瘤坏死因子α诱导PC12细胞凋亡及对bax和bcl-xl基因表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导PC12细胞凋亡以及对bax和bcl-xl基因表达的影响。方法以PC12细胞作为多巴胺神经元细胞模型,用MTT法测定不同浓度TNF-α对PC12细胞增殖的作用;用PI和AnnexinV进行细胞的双染凋亡检测及电镜检测PC12细胞凋亡;应用RT-PCR检测bax和bcl-xl基因mRNA表达的变化,用Westernblot检测bax和bcl-xl蛋白表达的变化。结果 TNF-α(1～100ng/ml)呈浓度依赖方式抑制PC12细胞增殖。30ng/mlTNF-α作用PC12细胞,PI双染及电镜均显示PC12细胞凋亡。RT-PCR表明药物作用后bcl-xlmRNA表达减少而baxmRNA表达增多;免疫印迹显示药物作用后bcl-xl蛋白表达减少而bax蛋白表达增多。结论 TNF-α诱导PC12细胞凋亡且呈量效关系,可能与bax和bcl-xl相关。     

靶向微管解聚蛋白stathmin siRNA对Aβ1-42诱发PC12细胞损伤的保护作用

目的:探讨微管解聚蛋白stathmin siRNA对β淀粉样蛋白片段(Aβ1-42)诱导PC12细胞损伤的保护作用。方法:构建靶向stathmin基因的shRNA真核表达载体;然后用脂质体转染的方法将重组质粒转染至大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞,用G418筛选得到稳定转染的细胞;通过RT-PCR和Western印迹方法分析stathmin基因mRNA及蛋白表达水平,筛选表达最低的稳定细胞株。用不同质量浓度的Aβ1-42诱导稳定细胞株,用MTT试验观察筛选稳定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,转染了重组载体pSilencer4.1-s的细胞中stathmin核酸和蛋白水平的表达均显著下调。与Aβ1-42处理的PC12细胞(63.88±2.36)和PC12-parental细胞(65.78±5.74)比较,Aβ1-42处理的PC12-s细胞(78.57±5.22)的存活率明显增加。用Aβ1-42处理过的PC12细胞(28.31±1.65)和PC12-parental细胞(26.65±3.64)的凋亡比用Aβ1-42处理过的PC12-s细胞(17.77±2.37)的凋亡明显增加。结论:Stathmin基因的下调对Aβ1-42诱导PC12细胞损伤具有保护作用,为阿尔茨海默病的治疗探索了一条新策略。     

松茸多糖对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导 PC12细胞损伤的影响

目的 探讨松茸多糖(TMP)对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP⁺)诱导PC12细胞损伤的保护作用机制。方法 选用MPP⁺体外构建PC12细胞帕金森病(PD)模型,将PC12细胞随机分为5组：对照组(Ctrl)、模型组(MDL)、TMP高浓度(250μg/L)组(TMP-H)、TMP中浓度(50μg/L)组(TMP-M)和TMP低浓度(10μg/L)组(TMP-L),每组3个复孔。TMP处理PC12细胞24 h后,250μmol/L MPP⁺诱导PC12细胞24 h制备PD细胞模型。用CCK-8法检测各组PC12细胞的细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测各组PC12细胞的LDH释放量,荧光显微镜摄片检测线粒体活性,Image J 1.53 r软件计算线粒体网络分支平均长度及网络分支数,JC-1法检测线粒体膜电位,Western blotting检测蛋白Bcl-2/Bax比值。结果 与Ctrl组相比,MDL组PC12细胞存活率下降,LDH释放水平升高,线粒体膜电位(ΔΨm)及Bcl-2/Bax比值下降(均P<0....     

siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性

目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.     

NAD(P)H:醌氧化还原酶1对多巴胺能细胞的保护作用

目的: 研究多巴胺(DA)对多巴胺能细胞的毒性作用、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)的保护作用及其机制。方法: 运用MTT法检测多巴胺对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)活性的影响;运用脂质体转染或Ⅱ相酶诱导剂预处理的方法对细胞进行预处理,并用免疫荧光方法检测转染效率;运用蛋白质印迹(Western blotting)方法检测细胞经过不同处理后胞内NQO1蛋白的表达情况;运用醌蛋白检测方法(硝基四氮唑蓝/甘氨酸法)检测细胞经不同处理后胞内醌化蛋白含量的变化。结果: 多巴胺对细胞具有剂量依赖性毒性,且与细胞内醌化蛋白的含量相关;脂质体转染和Ⅱ相酶诱导剂萝卜硫素(SF)均能使细胞内NQO1表达量增高;NQO1高表达能缓解多巴胺对细胞造成的毒性;细胞内NQO1表达量增高能减少多巴胺引起的细胞内醌化蛋白含量。结论: 细胞内NQO1的过表达可以减轻多巴胺对细胞产生的毒性作用。     

miR-422a通过调控SOX6抑制H_2O_2对PC12细胞的损伤

目的:研究微小RNA-422a (miR-422a)靶向调控人性别决定区Y框6(SOX6)对过氧化氢(H_2O_2)刺激下大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12(具有神经细胞特性)损伤的作用。方法:采用real-time PCR检测H_2O_2处理后PC12细胞中miR-422a表达的变化,在PC12细胞中转染miR-422a mimics,MTT法测定细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术测定细胞凋亡水平。靶基因预测软件预测SOX6可能是miR-422a的靶基因,萤光素酶报告基因实验鉴定靶向关系。在PC12细胞中共转染miR-422a mimics和SOX6过表达载体,检测过表达SOX6对miR-422a mimics调控H_2O_2条件下PC12细胞活力、LDH漏出率和凋亡的影响。结果:H_2O_2处理后PC12细胞中miR-422a表达水平降低(P0.05)。H_2O_2处理后的PC12细胞的活力降低,LDH漏出率和细胞凋亡率升高(P0.05)。miR-422a mimics能够提高H_2O_2条件下PC12细胞活力,降低LDH漏出率和凋亡率(P0.05)。miR-422a靶向负调控SOX6表达。SOX6过表达载体可以逆转miR-422a对PC12细胞活力提高和LDH漏出率、细胞凋亡率降低的作用(P0.05)。结论:miR-422a通过靶向抑制SOX6可降低H_2O_2对PC12细胞的损伤作用。     

β-神经生长因子基因克隆和诱导表达及其对PC12细胞的诱导分化作用

目的构建β-神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,应用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,探讨β-NGF在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况,及其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化的影响。方法从SD大鼠脑组织提取总RNA,反转录成c DNA,利用分子生物学技术,克隆鼠β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体p LVX-TRE3G-IRES中。将重组载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体p LVX-Tet3G分别转染空白HEK293FT细胞,制备收获慢病毒,共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000μg/L Dox诱导表达组)。48h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清,1.ELISA检测各组上清内β-NGF的分泌量;2.制作条件培养基,加入PC12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC12细胞诱导分化情况。结果双酶切和测序鉴定重组质粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确;β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多。诱导表达的条件培养基可诱导PC12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白。结论成功重组慢病毒载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的能力;运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达获得不同剂量β-NGF蛋白。     

Suppression of p53-activated gene,PAG608, attenuates methamphetamine-induced neurotoxicity

The p53-activated gene 608 (PAG608) is a proapoptotic gene activated and regulated by p53 expression in oxidative stress-induced apoptosis of neuronal cells. In this study, we determined the role of PAG608 in methamphetamine-induced neurotoxicity. Treatment of mouse dopaminergic CATH.a cells with 2 mM methamphetamine increased PAG608 expression at 3 h followed by increase in phosphorylated p53 expression. Transient transfection of PAG608 antisense cDNA or RNA interference using PAG608 small interfering RNA significantly attenuated the dose-dependent decrease in cell viability of CATH.a cells by methamphetamine (1–4 mM) exposure. In monoaminergic neuronal B65 cells, which contain serotonin rather than dopamine, methamphetamine-induced cell death was also significantly but partially protected by transient transfection of PAG608 antisense cDNA. Furthermore, cell death of PC12 cells produced by methamphetamine (1–5 mM) was almost completely prevented by stable expression of PAG608 antisense cDNA, compared with significant reduction of cell viability in control PC12 cells. Our results showed that suppression of PAG608 using transient and stable transfection with PAG608 antisense cDNA or small interfering RNA attenuates methamphetamine-induced death of various monoaminergic neuronal cells, suggesting that methamphetamine neurotoxicity in monoaminergic cells is related, at least in part, to induction of PAG608 expression.     

人app基因转染PC12细胞及效果检测

目的研究转染人app基因后PC12细胞的生物学性状变化和检测app基因在受体细胞中的蛋白表达水平。方法用脂质体转染对数生长期的PC12细胞,细胞分为3组:转染PCDNA3的正常对照组,app转染组和变异的V642Iapp转染组。用G418筛选阳性细胞,建立稳定表达的细胞株。采用Western印迹法检测目的基因蛋白质的表达情况。使用细胞形态学方法、MTT法观察转染后对生长的影响。结果Western印迹法显示,转染app和V642Iapp组有人的APP蛋白表达。细胞形态无明显改变,MTT测定转染后细胞的倍增时间和生长时间没有因为目的基因的导入而改变。结论正常条件下培养,过度表达人的APP对细胞的形态、倍增时间和生长无明显影响。     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

The effect of transfection with Botulinum neurotoxin C1 light chain on exocytosis measured in cell populations and by single-cell amperometry in PC12 cells

 We examined the effect on exocytosis in PC12 neuroendocrine cells of transient transfection with the specific endoprotease Botulinum neurotoxin C1 light chain (BoNT/C1), which cleaves syntaxin and SNAP-25. The effects of toxin expression on basal and evoked exocytosis were determined in cell population measurements and also in a single-cell transfection-amperometry assay. Co-expression of BoNT/C1 with human growth hormone (hGH) as a marker of secretory granules in transfected cells resulted in a 95% inhibition of hGH release evoked either by the purinergic agonist ATP or by depolarization with 55 mM K⁺. In addition, basal hGH release was also inhibited to the same extent. The high level of co-transfection efficiency revealed by this extent of inhibition was exploited in a high-resolution single-cell assay based on cell detection by expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) and analysis of evoked dopamine release by amperometry using a carbon fibre microelectrode. Cells expressing EGFP alone showed population responses and single-cell amperometric responses indistinguishable from those of control non-transfected cells. In contrast, co-expression of BoNT/C1 with EGFP resulted in an almost complete inhibition of current transients due to exocytosis evoked by ATP. These results establish and validate a single-cell assay of transfection-amperometry for analysing the effects of specific proteins on exocytosis. Received: 12 November 1998 / Received after revision: 8 December 1998 / Accepted: 9 December 1998     

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.     

siRNA对γδT细胞Eomes基因表达的抑制功能研究

本文旨在探讨RNA干扰对人外周血γδT细胞Eomes基因的表达和产生IFN-γ的抑制效应。化学合成3对EomessiRNA,脂质体转染试剂介导siRNA转染到用结核杆菌(Mtb)抗原刺激的人外周血单个核细胞中(主要是γδT细胞),通过转染条件优化后,对转染了siRNA的γδT细胞采用流式细胞术(FCM)进行分选,利用RT-PCR检测转染细胞EomesmRNA表达抑制率,以FCM检测转染前后γδT细胞IFN-γ产生的情况。结果显示,有2对siRNA能有效抑制Eomes的mRNA表达,并对γδT细胞IFN-γ的产生起抑制作用。提示Eomes siRNA可特异地抑制γδT细胞Eomes基因表达,Eomes可能是调控γδT细胞产生IFN-γ的重要转录因子。     

miRNA-21减轻氧糖剥夺对PC12细胞的损伤

目的:探讨微小RNA(miRNA)-21对低氧缺血损伤PC12细胞的影响。方法:体外培养PC12细胞,建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型。细胞随机分为对照组、OGD组、阴性对照序列+OGD组、miRNA-21 inhibitor+OGD组和miRNA-21 mimic+OGD组。通过采用CCK-8、real-time PCR、Western blot等技术探讨miRNA-21对OGD损伤PC12细胞的影响和机制。结果:降低miRNA-21的表达,受OGD损伤的PC12细胞活力明显下降;增加miRNA-21的表达,受OGD损伤的PC12细胞活力明显增加。进一步发现miRNA-21促进OGD损伤PC12细胞的AKT磷酸化。结论:miRNA-21明显增加OGD损伤PC12细胞的活力,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。     

TCRVβ7.1基因转染对肝癌细胞刺激的外周血单个核细胞ERK信号通路和IFN-γ表达的影响

目的： 研究肝癌特异性识别基因TCRVβ7.1表达重组体转染外周血单个核细胞(PBMCs)后对T细胞细胞因子表达的影响和信号通路的激活作用。方法: 以肝癌特异性T细胞受体Vβ7.1转染PBMCs,流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达量;Western blotting检测ERK1/2表达量及磷酸化水平（p-ERK）的改变;用ELISA法检测白细胞介素-4（IL-4）、γ-干扰素（IFN-γ）的表达量。结果: TCRVβ7.1基因转染健康人PBMCs并得到有效表达,转染TCRVβ7.1基因的PBMCs 与肝癌细胞共培养后ERK蛋白磷酸化水平明显高于未转染组(P<0.01)。p-ERK1/2水平与T细胞激活有关。ELISA结果表明,转染PBMCs细胞与肝癌细胞共培养后,IFN-γ水平明显高于未转染组,而IL-4无明显改变。结论: TCRVβ7.1转染PBMCs与肝癌细胞共培养后,ERK信号通路被激活,IFN-γ表达增高。