咪达唑仑对凝聚态Aβ25～35诱导的大鼠PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化和凋亡蛋白的影响

目的 探讨咪达唑仑对凝聚态Aβ25～35诱导的大鼠PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化的影响及凋亡相关蛋白表达的变化.方法 将培养的PC12细胞随机分为4组:对照组(C组);10μmol/L Aβ25～35(A组);20μmol/L咪达唑仑(M组);咪达唑仑和Aβ25～35(MA组),作用时间均为6小时.四甲基偶氮唑盐(M...     

氯胺酮上调GSK-3β活性加重Aβ25-35诱导的大鼠PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨氯胺酮对凝聚态Aβ<,25-35>诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)Tau蛋白过度磷酸化的影响及可能作用的机制.方法 将培养的PC12细胞随机分为对照组(C)、10 μmol/L Aβ<,25-35>(A组)、1 mmol/L氯胺酮(K组)、氯胺酮和Aβ<,25-35>(AK组),作用时间均为6 h....     

海马背侧注射β-淀粉样蛋白_(25～35)激活胶质细胞和p38丝裂原活化蛋白激酶诱导神经元凋亡

目的探讨海马背侧注射β-淀粉样蛋白25~35(Aβ25~35)后胶质细胞与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)激活的关系,及Aβ25~35诱导神经元凋亡的可能机制。方法采用免疫组织化学及免疫印迹方法观察海马背侧注射Aβ25~35后不同时段小胶质细胞(MG)、星形胶质细胞(AS)的激活和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)在海马组织中的表达;酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-1β(IL-1β)在海马组织中的含量;Nissl染色法观察海马神经元存活;TUNEL染色观察海马神经元凋亡。结果注射Aβ25~35后海马内抗特异性标记小胶质细胞(ox-42)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、和p-p38MAPK的表达与TNF-α、IL-1β的含量同步增加,于7d达到高峰,而Nissl阳性神经元数量逐渐减少,TUNEL阳性神经元数量则逐渐增多,亦于7d达到高峰。结论海马背侧注射Aβ25~35可能通过激活胶质细胞和p38MAPK,使TNF-α,IL-1β含量增加导致海马神经元凋亡。     

人参皂苷Rg1通过调节GSK-3β/PP2A活性减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨人参皂苷Rg1是否通过调节GSK-3β/PP2A活性而减轻凝聚态Aβ25～35诱导的胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.方法 选用孕期(18±2)d的SD大鼠,分离纯化胎鼠皮层神经元.实验分为阴性对照组、模型组、LiCl处理组、Rg1预处理组.阴性对照组不加任何处理因素;模型组用20μmol/L Aβ25～35作用于皮层神经元12h;LiCl处理组用10mmol/L LiCl和20μmol/L Aβ25～35共同作用于皮层神经元12h;Rg1预处理组分别用5、10、20、40、80μmol/L Rg1预处理皮层神经元24h,再加入20μmol/L Aβ25～35作用12h.通过免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测皮层神经元Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)表达水平,通过非放射性免疫法检测皮层神经元蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性.结果 模型组Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均增加,但PP2A的活性不受影响;LiCl处理组和Rg1预处理组,Tau蛋白在Ser396、Ser199/202和Thr231位点的磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的蛋白表达水平均降低(P＜0.05).在Rg1预处理组中,以20μmol/L Rg1预处理后Tau蛋白磷酸化水平、总Tau蛋白水平和GSK-3β的表达水平下降最为明显,而且PP2A的活性明显增强(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg1可通过上调PP2A活性和下调GSK-3β活性从而减轻凝聚态Aβ25～35所诱导的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化.     

天麻素通过蛋白激酶B/p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制H9c2心肌细胞凋亡

目的采用血清剥夺/复灌的大鼠H9c2心肌细胞模拟心肌缺血/再灌注损伤(I/R),从细胞层面探讨天麻素(gastrodin)抗H9c2心肌细胞凋亡的作用及其机制。方法体外培养H9c2心肌细胞随机分为对照组、血清剥夺(0.5~6 h)处理组、血清剥夺/复灌(2/4 h)处理组、天麻素(10、20和40μmol/L)处理组、天麻素(20μmol/L)+渥曼青霉素(wortmannin)(1μmol/L)处理组、wortmannin (1μmol/L)处理组。采用免疫印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt以及凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡;通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表达变化;采用免疫荧光双标记法检测细胞内p-Akt蛋白水平表达的变化。结果血清剥夺(0.5~6 h)和血清剥夺/复灌(2/4 h)处理诱导细胞凋亡水平增加;加入不同浓度天麻素处理,与血清剥夺(0.5~6 h)和血清剥夺/复灌(2/4 h)处理组比较,凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3表达降低,Bcl-2/Bax蛋白表达的比值上调(P0.05),基因转录水平检测的Caspase-3和Bax表达量降低,Bcl-2表达量上调((P0.05),流式细胞术凋亡检测结果也同样显示,天麻素能抑制血清剥夺/复灌(2/4 h)诱导的细胞凋亡(P0.05);同时,血清剥夺(0.5~6 h)和血清剥夺/复灌(2/4 h)处理能抑制Akt/p38MAPK信号通路;加入不同浓度的天麻素(10、20和40μmol/L)处理后,p-Akt的表达水平增多,p-p38MAPK蛋白表达减少(P 0.05)。加入Akt的特异性抑制剂wortmannin(1μmol/L)处理后,天麻素对上述因子的调控作用被反转(P0.05)。结论在H9c2心肌细胞中,天麻素通过激活Akt/p38MAPK信号通路,抑制血清剥夺/复灌诱导的细胞凋亡,从而发挥抗心肌I/R损伤的保护作用。     

一氧化氮激活应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶及p38MAP激酶诱导脑缺血再灌注后神经元凋亡

目的研究脑缺血区周边组织一氧化氮合酶（NOS）的表达与应激活化蛋白激酶／c—Jun氨基末端激酶（SAPK／JNK）及p38MAP激酶（p38MAPK）激活的关系;探讨一氧化氮（NO）诱导脑缺血再灌注后神经元凋亡的可能机制。方法采用TUNEL染色法观察脑缺血再灌注不同时段模型鼠缺血区周边组织凋亡的阳性神经元数量;免疫组织化学、蛋白免疫印迹方法检测活化型Caspase-3、神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和SAPK／JNK,p38MAPK及其磷酸化组分的表达。结果再灌注后1h、2h缺血区周边组织nNOS表达明显增强;自1h起iNOS开始表达,12h达到高峰。1hp-SAPK／JNK表达较强,以后逐渐减弱;p38MAPK各时段表达均明显增强,以6h为著,p-p38MAPK表达高峰亦在6h。6h活化型Caspase．3开始表达,12h达到高峰;12h开始出现TUNEL阳性神经元,24h达到高峰。结论缺血区周边组织NOS表达的增强可能通过激活SAPK／JNK及p38MAPK诱导脑缺血再灌注后神经元凋亡。     

β淀粉样蛋白25～35急性给药和慢性孵育对神经元Ca2+非依赖性的K+电流作用的比较

目的 探讨β-淀粉样蛋白25～35（Aβ _25-35）急性给药和慢性孵育对神经元Ca ²⁺非依赖性的K+电流作用的区别。 方法 急性分离大鼠海马及培养皮层神经元; Aβ25-35急性给药(3min)或慢性孵育（24h）;利用全细胞膜片钳技术记录Ca2+非依赖性的K+电流以及Calcein-AM法检测神经元活力。 结果 Aβ _25-35急性给药使急性分离的海马神经元Ca ²⁺非依赖性的K+电流幅度明显降低(n=11),而慢性孵育则使培养的皮层神经元该电流幅度明显升高(n=11)。前者是Aβ _25-35通过对K+通道直接的效应发挥其抑制作用,而后者可能主要是通过Aβ _25-35上调通道蛋白,改变通道数量而发挥作用。 结论 不同的给药方式通过不同的机制对海马和皮层神经元的Ca ²⁺非依赖性的K+电流产生不同的作用。     

与IGFBP-3相关的RXRα、STAT-1信号通路在β-淀粉样肽1～42诱导大鼠海马神经元凋亡中的可能作用

目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3）、视网膜X受体α（RXRα）及信号转导子和转录激动子（STAT-1）在β-淀粉样肽_1～42(Aβ_1～42)诱导大鼠海马神经元凋亡中的可能作用。方法 以原代培养的大鼠海马神经元为模型，分为对照组和Aβ_1～42组，加入不同浓度的凝聚态Aβ_1～42，原位缺口末端标记法（TUNEL）观察凋亡细胞的形态；免疫细胞荧光方法检测凋亡细胞及IGFBP3、RXRα阳性细胞；免疫印迹法检测RXRα蛋白和STAT-1蛋白的表达水平。结果 20μmol/L Aβ_1～42作用大鼠海马神经元24h能明显诱导神经元凋亡，表现为TUNEL/DAPI染色出现阳性细胞；20μmol/L Aβ_1～42作用大鼠海马神经元3～6h后IGFBP3阳性细胞、RXRα阳性细胞、RXRα蛋白的表达水平均较对照组有明显增高（P<0.01），在较高水平保持一段时间后逐渐下降；而STAT-1蛋白的表达水平则显著降低（P<0.01）。 结论 IGFBP3/RXRα或STAT-1信号转导通路可能在Aβ_1～42诱导大鼠海马神经元凋亡中起一定作用。     

冈田酸诱导大鼠海马神经元Tau 蛋白过度磷酸化

目的研究蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)对海马神经元微管相关蛋白(Tau)磷酸化的影响,建立Tau过度磷酸化的大鼠模型。方法实验随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA模型组。模型组又分为OA12h、24h、48h和2周组。OA模型组大鼠海马CA1区背侧定向注射1.5μl溶于10%DMSO的OA,DMSO对照组注射1.5μl10%DMSO溶液。通过Bielschowski染色、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分别观察海马神经元形态的改变和磷酸化Tau的表达水平;检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,了解其动态变化与Tau磷酸化的关系。结果OA模型各组与正常组和DMSO对照组比较,Bielschowski染色示海马神经元胞体和突起着色较深,欠均匀,部分神经元轴丘处浓染成斑块状,但各模型组均未见到老年斑和神经元纤维缠结样改变;免疫组织化学染色示模型组海马神经元Thr231和Ser199202磷酸化Tau蛋白表达增加,与DMSO对照组相比具有显著意义(P<0.05);蛋白免疫印迹提示OA可引起Tau蛋白Thr231、Ser396和Ser199/202位点发生磷酸化,且不同位点磷酸化的稳定性不同,注射OA48h后PP2A的活性明显降低,其变化与Tau蛋白Thr231和Ser396位点的磷酸化改变相一致。结论海马CA1区背侧单次注射OA可诱导建立神经元Tau蛋白过度磷酸化的大鼠模型。     

Age-associated changes in SAPK/JNK and p38 MAPK signaling in response to the generation of ROS by 3-nitropropionic acid

Mitochondrial dysfunction has been identified as a major source of oxidative stress in aged tissues. In this study we asked whether activities of components of the SAPK/JNK and p38 MAPK stress response signaling pathways are indicative of oxidative stress in aged mouse livers and whether these pathways are responsive to oxidative stress generated by 3-nitropropionic acid (3-NPA), an inhibitor of complex II (succinic dehydrogenase). We asked whether (a) aging affects the basal activity of the SAPK/JNK stress signaling pathway; (b) specific isoforms of JNK, i.e. 46 or 54 kDa JNKs are activated by 3-NPA; (c) aging affects the response of this signaling pathway to 3-NPA; (d) there is a cross pathway activation of JNK or p38 MAPK by upstream activators. Our studies have shown that although their protein pool levels are not altered, the basal JNK activities using c-Jun as substrate is elevated. Furthermore, in aged livers, JNK activity is induced to a greater extent and takes longer to recover from 3-NPA treatment. The activities of the upstream activators of JNKs, MAP kinase kinase (MKK) 4 and 7, are also elevated in livers of aged C57BL/6 male mice. These activator kinases, which are induced (phosphorylated) by 3-NPA in young livers, are not inducible by this inhibitor in aged livers. In fact, these proteins are highly phosphorylated in the control aged livers and are dephosphorylated in response to 3-NPA. Finally, we demonstrate for the first time that MKK7 serves as an upstream activator of p38 MAPK and that MKK3 and MKK6 activates 54 kDa JNK2 in aged liver. Our studies suggest that failure to respond to 3-NPA may be indicative of the susceptibility of aged tissue to oxidative stress, supporting our hypothesis that aged tissues (especially liver) develop a state of chronic stress even in the absence of a challenge.