右旋糖苷及PEG—2对大肠杆菌L—天冬酰胺酶的化学修饰

本文综述了活化右旋糖苷和含有两条聚乙二醇链的ＰＥＧ－２对大肠杆菌Ｌ－天冬酰胺酶的化学修饰。修饰酶可保持５０％酶活，并且明显提高了抗胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶水解的能力，降低对特异的天冬酰胺酶抗体的敏感性，体内实验还表明修饰酶在动物体内循环持久性延长，使之更适于作为治疗药物。     

大肠杆菌L—天门冬酰胺酶的提取和纯化

用蔗糖溶液提取菌体细胞周质中的天门冬酰胺酶，所获得的粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维柱层析和羟甲基纤维素柱层析纯化，获得了比活为220IU/mg，SDS-PAGE显示一条带的L-天门冬酰胺酶。     

大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ的基因克隆与表达

本文报道用一对与大肠杆菌编码L-天门冬酰胺酶Ⅱ（L-ASPsⅡ）的基因ansB两侧序列互补的寡核苷酸L1、L2作引物，以L-ASPsⅡ的野生型生产菌CPU210009染色体为模板，经PCR扩增得到长约1.6Kb的DNA片段。该片段通过以LP1、LP2为内引物的PCR反应，证明包含了ansB基因的编码序列。将此片段经xba I、Hind Ⅲ消化，插入质粒PUC18、PUC19上构建重组质粒PUA18、PUA19，分别转化Asl.1187,Asl.1193,HB101,9637,JM107,71/18,GPU210009等宿主菌，筛选得到L-ASPs Ⅱ酶活力明显提高的8株阳性转化子。在1L生物反应器中，LB培养基37℃下培养24h，其酶活在6.2-31.8IU/ml之间。其中CTA8表达L-ASPsⅡ水平最高，达到31.8IU/ml。各基因工程菌株较之野生型生产菌体CPU210009，其生产L-ASPsⅡ水平提高了5-26倍。而且IPTG诱导对工程菌表达L-ASPsⅡ的水平几无影响。SDS-PAGE测得工程菌表达的L-ASPsⅡ分子量约为140Kd。薄层扫描结果显示：CTA7、CTB8、CTA9所产生的L-ASPsⅡ占宿主菌可溶性蛋白总量的28.3%、35.7%、33.6%。     

Ｌ—天门冬酰胺酶Ⅱ的表达与纯化

依据发表的大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因序列,合成引物,利用ＰＣＲ技术获得天门冬酰胺酶Ⅱ的结构基因,插入高效表达载体pＢＶ２２０,并转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α,获得高效表达天门冬酰胺酶Ⅱ的基因工种菌株,通过对包涵体的提取与纯化,结合离子交换层析获得天门冬酰胺酶Ⅱ的蛋白质纯品。检测结果表明得到的天门冬酰胺酶Ⅱ具有较高的比活性,与商品化的同类产品比活相近。     

L—天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进

目的：改进L－天门冬酰胺酶的提纯工艺，使成品达到中国药典型标准。方法：在工艺流程中改溶菌酶破裂，蔗糖提取为丙酮破裂，稀盐提取，并增加了亲和层析的工序。结果：提取的L－天门冬酰胺酶活力提高到250IU／mg，纯度达到98％以上，产率达到40％，结论：本工艺优于吴氏工艺，成品达到中国药典标准。     

L—天门冬酰胺酶产生菌的快速筛选方法

采用一种简易，快速、微量的奈斯勒试剂显色法，可直接从细菌固体培养物中筛选出产生Ｌ－天门冬酰胺酶的细菌。该法适用于从大量菌株中快速筛选Ｌ－天门冬酰胺酶产生菌。     

HPLC用于重组L—天门冬酰胺酶Ⅱ的纯度分析与肽图谱测定

目的：为了对重组Ｌ－天门冬酰胺Ⅱ进行肽图谱测定,以比较不同来源产品间一级结构的一致性。方法：运用梯度洗脱／反相高效液相色谱汉对榈进行纯度检查和肽图谱测定,并提出了简单的三氯乙酸变性方法,以解除蛋白质抗胰蛋白酶水解的能力。结果：建立了重组Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ的三氯乙烃笥／胰蛋白酶水解测定肽图谱的ＨＰＬＣ方法,肽图谱的比较反映出不同样品间的一级结构间存在差异。结论：建立的肽图谱测定方法,过程简便,便于常     

重组L-门冬酰胺酶的聚乙二醇化学修饰及修饰后酶的稳定性研究

目的单甲氧基聚乙二醇 (mPEG)化学修饰大肠杆菌重组L 门冬酰胺酶 (L ASP) ,考察经过修饰的酶的稳定性。方法N 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)活化酯法活化mPEG ,生成的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰琥珀酸亚胺酯 (SS mPEG)按不同摩尔比例与L ASP偶联 ,确定适合的反应时间和反应pH值。通过聚乙二醇化学修饰后的酶 (L ASP PEG) ,酶活力和纯度通过奈氏法和丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)检测 ,高效液相色谱检测L ASP PEG相对分子质量并考察了L ASP PEG体外稳定性等。结果SDS PAGE显示mPEG已经偶联到L ASP分子上 ,以两者摩尔比 1 0∶1为最佳 ,反应pH条件为 8.5 ,获得的L ASP PEG平均比活单位为 6 4 .8IU/mg ,相对分子质量为 30 1 80 0 ,体外稳定性高于L ASP。结论此实验确定了mPEG化学修饰L ASP最佳反应条件为 2 5℃反应 30min ,两者投料摩尔比为 1 0∶1 ,获得的L ASP PEG比L ASP稳定性高     

817例低分子右旋糖苷的不良反应

目的:探讨低分子右旋糖苷所致不良反应(ADR)的一般规律及特点。方法:对1994年～2006年低分子右旋糖苷不良反应13年间的国内文献源进行统计分析。结果:低分子右旋糖苷的不良反应主要发生在小于5min和大于3d两个时间段,不良反应以皮肤及附件、心血管系统为主,分别占不良反应的53.73%和23.13%,其次为泌尿系统(18.60%)的不良反应。在817例不良反应中可痊愈的为719例,占88.0%,33例患者中有严重后遗症的占4.04%,有62例因抢救无效死亡的占7.59%,另有3例病危自动出院的占0.37%。结论:低分子右旋糖苷不良反应涉及多个系统,应合理应用低分子右旋糖苷,尽量减少不良反应的发生。     

重组L—门冬酰胺酶Ⅱ的提取与纯化工艺

采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀,乙醇分级沉淀,ＤＥＡＥ－纤维素层析等步骤提取和纯化重组Ｌ－门冬酰胺酶Ⅱ,并优化提纯过程的条件,提取总回收率高于５０％,产品纯度经高效毛细管电泳检测为单一峰,具有工业生产前景。     

植物天门冬酰胺连接酶在大环肽类药物应用中的研究进展

植物中的天门冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidases, AEPs)属于半胱氨酸蛋白酶家族,以酶原的形式在酸性液泡中发生自激活,在种子储存蛋白成熟、蛋白质降解、细胞程序性死亡和宿主防御中发挥着重要的生理作用。最近从几种富含环肽的植物中分离鉴定了促进环肽成熟的生物加工酶-天门冬酰胺连接酶(peptidyl Asxspecific ligases, PALs),由AEPs进化而来,可位点特异性催化天冬酰胺或天冬氨酸肽键的生成,由于相对无痕和宽泛的底物谱以及催化效率高等优势,已经在多肽和蛋白质的环化和修饰方面起到重要作用,是提高多肽类药物稳定性的有力工具。本文介绍了AEPs在植物中的生理功能,综述了PALs的发现、结构特点、催化机制和蛋白质工程,以及限制其应用的原因和未来的发展趋势。此外,还重点阐述了PALs在环肽生物合成以及在大环肽类药物开发中的应用,旨在为生物催化合成环多肽类药物提供一种新思路。     

卡那霉素B的酶—化学修饰

用酶—化学修饰的方法,对卡那霉素B的C_3~′位进行化学结构改造。利用耐药菌E.coliK.12 ML1629产生的钝化酶选择性地使卡那霉素B的C_3~′位羟基磷酸化,再用化学方法,将卡那霉素B-3~′—磷酸酯转化为3′—氯代—3′—去氧卡那霉素B,进而合成3′去氧卡那霉素B,即妥布拉霉素。     

重组L—门冬酰胺前体脂质体与重组L—门冬酰胺酶对小鼠毒性作用比较

为了考查Ｌ－门冬酰胺酶（Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ,Ｌ－ＡＳＮａｅｓ）前体脂质体（Ｐｒｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）（Ｌ－ＡＳＮａｓｅＰＬ）与Ｌ－ＡＳＮａｓｅ的急性毒性及对外周血中白细胞总数及血小板数的作用。脂质体组小鼠静脉注射给药（Ｌ－ＡＳＮａｓｅ－ＰＬ）,给药剂量为给药物浓度（４０００ＫＵ／ｍｌ）,最大静脉注射体积（０．５ｍｌ／２０ｇ）;Ｌ－ＡＳＮａｓｅ组给药体积为０．４ｍｌ／２０ｇ,给药一次,给药     

单甲氧聚乙二醇化学修饰药物酶的研究进展

用单甲氧基聚乙二醉(1)化学修饰药物酶是生化药物研究开发的重要手段之一。本文综述了1化学修饰药物酶的一般方法及修饰后酶在生物和理化性质方面的变化，同时对1研究前景进行展望，并指出了尚待解决的问题。     

右旋糖苷衍生物纳米粒对人乳腺癌细胞的转染作用研究

目的以右旋糖苷为起始反应物制备对人乳腺癌细胞具有高转染活性的右旋糖苷衍生物纳米粒非病毒基因载体。方法先将右旋糖苷40与高碘酸钠以不同的配比进行反应,生成醛基含量不同的氧化右旋糖苷;氧化右旋糖苷与精胺以不同的配比反应,共生成9种右旋糖苷衍生物纳米粒;以绿色荧光蛋白基因为报告基因、mda-mb-435人乳腺癌细胞为转染细胞,考察9种合成物的基因转染活性,从中选出转染活性最高的生成物。结果高碘酸钠与右旋糖苷40按摩尔比为0.8∶1反应生成氧化右旋糖苷;该氧化右旋糖苷再与精胺按1∶1的摩尔比继续反应,生成的终产物的转染效率最高。结论制备出了对mda-mb-435人乳腺癌细胞具有高转染活性的右旋糖苷衍生物纳米粒非病毒基因载体。     

右旋糖苷铁注射剂治疗缺铁性贫血的思路研究

目的分析和研究右旋糖苷铁注射剂治疗缺铁性贫血临床效果。方法我们选取2011年7月至2013年2月缺铁性贫血患者76例,将其随机分为观察组(38例)与对照组(38例)。对照组患者给予口服多糖铁胶囊治疗;观察组患者给予注射右旋糖苷铁治疗,将两组患者治疗结束后的效果进行对比。结果观察组患者治疗总有效率明显高于对照组(P<0.05),具有统计学意义。观察组患者治疗后的血红蛋白(HB)、血清铁蛋白(SP)检测值明显优于对照组(P<0.05),具有统计学意义。两组患者在治疗期间均没有发生明显的不良反应症状。结论将右旋糖苷注射剂应用于缺铁性贫血患者的治疗中,能够纠正患者贫血症状,有效促进其体内红细胞生成,对提高患者生活质量及减少并发症发生均有重要意义。     

聚乙二醇化学修饰的重组L-门冬酰胺酶对小鼠白血病细胞P388的抑制作用

目的 :考察聚乙二醇 (polyethyleneglycol,PEG)化学修饰的重组L 门冬酰胺酶 (recombinantL asparaginase ,rL ASP)的抗肿瘤活性。方法 :PEG化学修饰rL ASP ,获得的化学修饰酶 (polyethylenegly colmodifiedrecombinantL asparaginase ,rL ASP PEG)利用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (sodi umdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis ,SDS PAGE)观察其分子大小变化 ,四甲基偶氮唑盐(3 (4 ,4 dimcthylthioazol 2 yl) 2 ,5 diphenyl tetrazoliumbromide ,MTT)法和流式细胞仪 (flowcytometer,FCM )检测rL ASP PEG对体外培养的小鼠白血病细胞P3 3 8增殖作用的抑制作用 ,腹腔给药考察rL ASP PEG对小鼠移植性实体瘤P3 3 8抑瘤效果 ,透射电镜(transmissionelectronmicroscopy ,TEM )观察rL ASP PEG引起的肿瘤组织超微病理变化。结果 :SDS PAGE显示 ,rL ASP PEG的分子量大于rL ASP ;MTT实验表明 ,rL ASP PEG能抑制体外培养的小鼠P3 88白血病细胞的增殖 ,半数有效浓度 (inhibitoryconcen tration 5 0 % ,IC50 )为 2 .0 5 6IU·ml-1。FCM结果表明 ,rL ASP PEG主要将肿瘤细胞P3 88抑制在G0 G1期 ,S期细胞减少。DBA 2荷瘤小鼠的抑瘤实验表明rL ASP PEG对移植性实体瘤P3 3 8有显著抑制作用 ,P值     

大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ作为多肽呈现载体的可行性研究

为了研究大肠杆菌L-H冬酰胺酶Ⅱ（Lasparaginasell，AnsB）能否作为多肽呈现载体。选取乙肝病毒表面抗原（HBSAg）preS2结构域的核心抗原表位区作为模型多肽，构建了两种表达载体pET28a-AnsB-preS2L和pET28a-AnsB-preS2C，分别转化至表达宿主菌E.coliBL-21，LB培养基（Kan^r）培养，乳糖诱导高效表达，通过渗透休克，DEAE 52-cellulose柱层析纯化获得了在AnsB C端融合有线状和环状模型多肽的嵌合酶AnsB-preS2L和AnsB-preS2C，两种嵌合酶分别保留了AnsB 81％、25％的催化活力，两者的pH稳定性均与AnsB相符。ELISA检测结果显示AnsB-preS2L与抗preS2抗体的结合能力较AnsB-preS2C强。证明AnsB确实能够作为一种表面呈现载体将线性外源多肽以融合表达的方式呈现在酶分子的表面，最终形成一种在每个亚基表面呈现有多肽的嵌合酶。最后，用富含带电序列的8肽（KRKRKKSR）替换核心抗原表位区作为模型多肽，进一步验证了AnsB作为多肽呈现载体的可行性和通用性。     

β-环糊精对L-天门冬酰胺酶的稳定作用

目的 研究β—环糊精(β—CD)对L—天门冬酰胺酶(L—Asnase)稳定性的影响。方法 用β—CD对L—Asnase进行修饰，并对修饰后酶的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力进行了研究。结果 修饰后酶的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力明显提高。结论 β—CD对L—Asnase具有明显的稳定作用。     

重组L—门冬酰胺酶前体脂质体对急性淋巴白血病小鼠的治疗作用和毒性考察

目的考察重组L-门冬酰胺酶前体脂质体(L-ASNasePL)与重组L-门冬酰胺酶（L-Asparaginase,L-ASNase）对移植性小鼠急性淋巴白血病的作用,及相关急性毒性。方法采用DBA／2小鼠L1210腹水瘤模型,L-ASNasePL组和L-ASNase组小鼠每天腹腔注射一次,连续10d。另设L-ASNasePL组小鼠静脉注射给药,给以最大药物浓度（4000kU·m1