基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

检测蚊虫感染黄病毒属病毒Real-time PCR方法的建立

目的 建立SYBR Green Real-time PCR检测和筛选黄病毒属病毒方法. 方法 参照文献报道的通用引物,以JEV cDNA 和DEN cDNA为模板,建立RT-PCR和SYBR Green Real-time PCR,检测和筛选黄病毒属病毒,并比较两者的敏感性. 结果 此黄病毒属引物适合两种反应体系,SYBR Green Real-time PCR方法的敏感性是RT-PCR方法的100倍,最低检出病毒浓度为0.5×10-2 PFU/ml. 结论 建立的两种方法均可用于黄病毒属病毒检测,以SYBR Green Real-time PCR方法具有更高的敏感性,对于黄病毒属病毒初筛检测具有应用价值.     

检测基孔肯雅病毒SYBR Green I real-time PCR方法的建立及应用

目的建立一种基孔肯雅病毒的快速诊断方法。方法采用基孔肯雅病毒E1基因的重组质粒作为阳性标准品。优化反应条件,建立针对基孔肯雅病毒的SYBR Green I real-time PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法的Ct值与阳性标准品在6.94×10~0～6.94×10~8 copies/μl范围内呈良好的线性关系,相关性为0.997,斜率为-3.571;其检测下限为0.694 copies/μl,且对ZIKV、DENV和JEV等均无特异性扩增;所有稀释倍数的标准品在84.0℃出现特异性熔解峰;组内和组间变异系数均小于2%。采用该方法对93份蚊虫样品进行检测,基孔肯雅病毒核酸阳性率为2.15%,普通PCR核酸阳性率为1.07%。结论成功建立了针对基孔肯雅病毒E1基因的SYBR Green I real-time PCR检测方法。该方法灵敏、特异,可用于基孔肯雅病毒感染的快速诊断。     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法.方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果 该法检测的线性范围为6.4×101～6.4×107拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×103拷贝/反应的标本批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.6%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为(80.40±0.18)℃.结论 SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-Ⅰ的进一步研究奠定基础.     

SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲型H1N1与季节性流感病毒方法的建立

目的：建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。方法：设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,同时进行熔解曲线和Tm值分析,并作灵敏度和重复性试验。 结果：结果表明该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应。构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为：95.588%,检测灵敏度为101copies/反应体系,结果重现性好。成功地验证性检验了32份盲样标本。结论：本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测。     

猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法,并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×10~1~4.24×10~8拷贝/μl范围内呈良好线性关系,其相关系数为0.996,斜率为-4.384。该方法特异性强,与PRRSV、FMDV、JEV、PCV2及PRV均无交叉反应;敏感性为4.24×10~1拷贝/μl,比常规PCR方法高10倍;组间和组内重复试验的变异系数均小于2%。利用实时荧光定量PCR方法对采集的155份猪肺组织进行检测,阳性率为36.13%,高于普通PCR阳性检出率的32.25%。结论建立的PCV3SYBR GreenⅠReal-time PCR方法敏感、特异,可用于猪体PCV3感染的快速检测。     

猪逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的开发一种能够准确、灵敏、特异检测猪逆转录病毒(PERV)的荧光定量PCR方法。方法根据GenBank数据库中PERV Gag基因的高度保守序列,设计1对特异性引物,建立用于检测PERV的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,并验证其灵敏性、重复性和特异性。结果建立的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.998。该方法检测PERV下限为2.04×10^(2)copies/μl,批内批间变异程度较低,变异系数小于2%,且与PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和SVA等均无交叉反应。利用该qPCR方法对采集的49份猪组织样品进行检测,阳性率为81.63%,高于普通PCR阳性检出率的73.47%。结论建立的快速、定量检测PERV的SYBR Green I qPCR方法敏感、特异,具有一定的应用前景。     

SYBR GreenⅠ实时PCR用于血小板抗原HPA-2、3基因分型的研究

目的:应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术,建立一个血小板抗原HPA-2、3的基因分型方法。方法:应用SYBR GreenⅠ实时PCR,分别扩增样本的HPA-2、3的a和b等位基因。在PCR反应后,依据a和b等位基因Ct值的差值△Ct,使用聚类分析K-means cluster分析法,确定HPA-2、3的基因型。将SYBR GreenⅠ实时PCR的基因分型结果和常规PCR-SSP法进行比较。此外对该法的重复性进行评价。结果:105个血液样本的SYBR GreenⅠ实时PCR基因分型结果和常规PCR-SSP法完全一致。10个血样的2次SYBR GreenⅠ实时PCR基因分型结果是一致的。结论:HPA的SYBR GreenⅠ实时PCR分型方法具有快速、简单、准确、通量高、重复性好等优点,要优于常规的PCR-SSP法。     

贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法的建立

目的建立贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒快速检测与分群方法。方法对比分析6株主要流行的GⅠ、GⅡ诺如病毒及参考诺如病毒的基因序列,筛选保守区域引物,优化建立SYBR Green Ⅰ荧光定量检测与熔解曲线快速分群方法,并对实际样品检测验证。结果引物P289/290可同时检测GⅠ、GⅡ诺如病毒,SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法在病毒浓度10~3～10~9 copies之间呈现良好的线性关系(R~2=0.993,P0.01),熔解曲线Tm值可区分GⅠ和GⅡ不同基因群的诺如病毒(F=7 507.60,P0.05)。120份贝类样品阳性检出率5.83%,其中阳性结果测序鉴定与快速分群方法结论一致。结论该方法成本低、检测快速、分群准确,具有良好重复性,适用于贝类中GⅠ、GⅡ诺如病毒的快速检测与分群。     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

基于实时荧光环介导等温扩增的HPV16及HPV18检测体系的建立

目的建立用于人乳头瘤病毒HPV16及HPV18快速检测的实时荧光环介导等温扩增技术。方法运用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V5,针对HPV16、18基因保守序列设计扩增引物,在反应前加入核酸染料SYBR GreenⅠ并对LAMP反应体系中内引物、Mg2+、dNTPs进行优化,优化结果通过实时荧光扩增曲线确定;然后对优化的HPV16、18 LAMP反应体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。结果建立的实时荧光环介导等温扩增体系检测HPV16及HPV18的特异性为100%,与qPCR方法的符合率为100%。该体系检测HPV16及HPV18质粒的灵敏度为10拷贝/μl。结论建立的实时荧光环介导等温扩增体系检测HPV16、18简便、快速,灵敏度高,可用于HPV感染的早期筛查。     

人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立

目的：建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法：依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物，以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版，以TBP基因为参照基因，应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果：POT1和TBP基因熔解曲线为单峰，无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同（直线斜率0．0171〈0．1）。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3％和2.1％；TBP基因批内变异与批间变异分别为1．2％和2．6％。结论：建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法，该方法简单快速，经济，灵敏度高，特异性和重复性好，可用于人类POT1基因的定量分析。     

恶性疟原虫体外药敏实验检测方法的比较研究

目的 目的 比较WHO微量测试法 （WHO microtest）、 疟原虫乳酸脱氢酶 （Plasmodial lactate dehydrogenase, pLDH） ELISA测定法、 富组蛋白Ⅱ （Histidine?rich protein Ⅱ, HRP Ⅱ） ELISA测定法和SYBR Green Ⅰ荧光测定法等4种恶性疟原 虫体外药敏实验检测方法, 确定一种较为稳定、 简便快速且经济的体外药敏实验检测方法, 用于后续疟原虫敏感性的监 测及新型抗疟药的筛查。 方法 方法 以恶性疟原虫虫株3D7、 FCC、 K1、 Dd2为对象, 分别采用WHO microtest法、 pLDH法、 HRP Ⅱ法和SYBR Green Ⅰ法测定其对氯喹、 哌喹和阿莫地喹的敏感性, 并采用Friedman检验、 偏相关分析、 Pearson相关 分析和Bland?Altman分析对4种药敏检测方法的IC50值进行分析。 结果 结果 在初始密度为0.5%～1.0%时, 4种方法的IC50 值之间的差异无统计学意义 （P > 0.05）, 任意2种方法间均呈直线相关关系 （P < 0.001）。WHO microtest法技术要求高、 耗时长且结果判定受主观影响; HRPⅡ法的敏感性高于pLDH法和SYBR Green Ⅰ法, 但成本高; SYBR Green Ⅰ法技术要 求低、 耗时短且成本低。 结论 结论 SYBR Green Ⅰ法是一种较为便捷、 经济的检测方法, 适用于大规模监测疟原虫药物敏感 性及研究新型抗疟药。     

猪嵴病毒 SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒（porcine kobuvirus,PKV）株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测PKV 3D蛋白在6.42×102 ~ 6.42×108拷贝/反应范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为（84.94±0.24）℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强。所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%~1.14%,组间变异系数0.63%~1.79%,重复性好。本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染程度和靶器官提供新的检测方法。     

人乳头瘤病毒16亚型LAMP检测法的建立

目的本研究旨在建立一种简单、快速、灵敏的检测方法,使环介导等温扩增技术(LAMP)应用于HPV16亚型的检测。方法根据Gen Bank登录的HPV16亚型序列(FJ610152)中E7基因序列设计了多套特异引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对HPV16亚型的LAMP引物进行筛选并对反应体系和反应条件进行检测和实时监控以检测其特异性和敏感性。反应结束后加入SYBR Green I染料肉眼判定并与仪器检测结果进行比对。结果建立的LAMP方法在61℃下可对HPV16核酸进行高效扩增,反应结束后加入染料肉眼判定结果与Real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为3.0×103 copies/μL)。LAMP法与HPV分型试剂盒对35份样品的检测结果一致。结论本研究建立的可视化LAMP方法操作简便,适用于HPV16的快速检测。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法。方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性。结果 该法检测的线性范围为6.4×10^1～6.4×10^7拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×10^3拷贝/反应的标本批内变异系数（CV）和日间CV分别为1.6%和2.8%。熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为（80.40±0.18）℃。结论 SYBR Green I实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-1的进一步研究奠定基础。     

肺癌患者血浆MGMT基因异常甲基化检测方法的初步研究和临床意义

目的探讨MGMT(O6-methylguanine-DNA methyltransferase)基因异常甲基化的血浆检测方法和临床意义。方法首先对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行改良设计研究,寻求最佳的实验方法和条件,然后利用改良的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法分别对肺癌患者和正常人的血浆进行异常甲基化MGMT基因检测。结果在反应体系中增加75℃30s这一步骤可有效消除非特异性扩增产物,使测量定量结果更加精确。18例肺癌患者中,鳞癌1例为阳性,占20%;小细胞肺癌1例阳性,占33.33%;腺癌4例阳性,占40%。结论利用改良的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法可以检测到肺癌患者血浆异常甲基化MGMT的存在;肺腺癌阳性率最高,提示不同肿瘤细胞基因表达存在很大差异;同时也为无创伤性诊断肺癌提供了一种具有临床实用价值的方法。