经静脉移植间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移

目的：观察^67Ga-Oxine标记间充质干细胞的可行性，检测经静脉移植的间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移和分布。方法：实验于2004—01／2005—01在北京大学干细胞研究中心完成。①从人脐带血分离培养间充质干细胞，体外进行^67Ga-Oxine和Hoechst33342标记。（2）SD大鼠40只随机分为两组，实验组（脊髓损伤大鼠20只）和对照组（正常大鼠20只）均经尾静脉注射相同标记细胞悬液。③分别于1d和1周后取材，新鲜组织（脊髓、肺、肝、脾、肾、骨髓、静脉血）称湿重后伽玛计数仪检测其放射性，计算肺、肝、脾、肾、骨髓分别与静脉血单位质量放射性计数的比值，两组比较分析；实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较。相应组织做冷冻切片（包括骨髓涂片），荧光显微镜观察Hoechst33342标记细胞在各组织内的分布。结果：40只SD大鼠全部进入结果分析。①体外间充质干细胞的^67Ga-Oxine标记率为82．5％，放射活性为15．26MBq／10^6细胞，标记48h后细胞存活率〉95％。（2）移植1d和1周后肺、肝、脾、肾、骨髓与静脉血单位质量放射性计数的比值，实验组与对照组对比差异均无显著性（P〉0．05）。实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较，1d后差异无显著性（P〉0．05），1周后实验组明显高于对照组（1．441&;#177;0．038，1．003&;#177;0．022，P〈0．01）。（3）相应组织连续冷冻切片荧光显微镜观察显示移植初期Hoechst33342标记细胞主要集中于肺部，而后在肝、脾、骨髓逐渐增加可持续到1周后。移植1d后脊髓未见明显标记细胞，1周后实验组损伤脊髓部位标记细胞明显增加并相对聚集于灰质。结论：间充质干细胞可在体外应用^67Ga—Oxine成功标记，为核素显像示踪移植间充质干细胞的相关研究提供了依据。经静脉移植的间充质干细胞可以迁移到损伤脊髓，为应用间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种可能的无创性移植方法。     

骨髓间充质干细胞向脊髓损伤区的迁徙☆

背景:骨髓间充质干细胞移植到脊髓损伤区域后,如何观察其在体内的生存和转归情况,一直是让人困扰的问题。目的:观察骨髓间充质干细胞在大鼠脊髓损伤区内的迁徙情况。方法:36只Wistar大鼠随机分为2组,实验组制作脊髓损伤模型1周后,经尾静脉移植用DAPI标记的骨髓间充质干细胞(1×109L-1)1mL,连续注射2d。对照组未行脊髓损伤,与实验组同一时间同法行骨髓间充质干细胞移植。分别于移植后5,10,15d,制作损伤脊髓冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞的迁徙情况。结果与结论:实验组于移植后5d,在脊髓损伤组织血管内出现少量荧光标记的骨髓间充质干细胞,10d后有血管外弥散,15d后有广泛弥散。对照组均未见DAPI标记的骨髓间充质干细胞。结果表明骨髓间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后,能透过血脊髓屏障向损伤脊髓组织迁徙。     

静脉移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白43、神经丝蛋白及巢蛋白的调节

目的:已证实骨髓间充质干细胞不仅具有向中胚层间质细胞分化的能力,在一定条件下或微环境中还能够向外胚层和内胚层细胞分化。为此观察静脉移植骨髓间充质干细胞对脊髓损伤后生长相关蛋白43、神经丝蛋白及巢蛋白的影响。方法:实验于2004-12在四川大学华西医院组织工程实验室完成。①实验动物:雌性SD大鼠66只,随机数字表法分为3组:细胞移植组、注射液对照组、模型对照组,22只/组。另取6周龄SD大鼠10只用于骨髓间充质干细胞的分离培养。②实验方法:应用密度梯度离心、贴壁培养和酶消化控制相结合,分离纯化鼠骨髓间充质干细胞。传至第6代在移植前1d予以BrdU标记,制成浓度约为2×109L-1细胞悬液。各组大鼠均建立脊髓损伤模型,造模后1周作尾静脉穿刺,细胞移植组注入骨髓间充质干细胞悬液1mL,注射液对照组注入等量的无血清低糖培养基,模型对照组未作处理。③实验评估:分别于细胞移植后2,3,6周取材,免疫组织化学检测骨髓间充质干细胞在损伤段脊髓的存活情况,观察损伤段脊髓内生长相关蛋白43、神经丝蛋白及巢蛋白的表达。结果:①骨髓间充质干细胞存活及计数:移植后2,3,6周BrdU阳性的骨髓间充质干细胞主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内,计数分别为(9830±874)个,(8780±720)个,(5700±420)个,各占移植细胞总量的4.9%,4.4%,2.9%。②生长相关蛋白43及神经丝蛋白的表达:细胞移植后2,3,6周,细胞移植组生长相关蛋白43及神经丝蛋白的表达面积均明显高于其余两组(P<0.05)。③巢蛋白的表达:细胞移植后2,3周,细胞移植组的巢蛋白阳性细胞数均明显高于其余两组(P<0.05)。至第6周细胞移植组巢蛋白阳性细胞数明显降低(P<0.05),其余两组不表达。结论:脊髓损伤后静脉移植的骨髓间充质干细胞能向脊髓损伤灶内迁徙、存活,上调生长相关蛋白43、经丝蛋白及巢蛋白的表达。     

骨髓间充质干细胞移植入脑缺血大鼠侧脑室后的迁移及分化:免疫荧光标记

目的:骨髓间充质干细胞可以分化成神经细胞替代受损组织,并可分泌生长因子和营养因子来促进其体内细胞的存活和分化。实验将体外扩增和Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞移植入缺血性大鼠侧脑室内,观察干细胞在大鼠脑内的生存、迁移、分化情况及对神经功能恢复的影响。方法:实验于2004-12/2007-06在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成。①取体质量120～160g的SD大鼠用于制备移植细胞;另取80只体质量250～300g的SD大鼠用于制作大脑中动脉闭塞模型。实验方法符合动物伦理学要求。②应用直接贴壁法分离纯化及扩增大鼠骨髓间充质干细胞,荧光染料Hoechst33342标记。③将造模成功的75只大脑中动脉闭塞大鼠按随机数字表法分为3组:模型对照组15只;磷酸缓冲液组30只;骨髓间充质干细胞移植组30只,将骨髓间充质干细胞立体定向移植到大鼠缺血侧脑室中。④术后1,3,6,12,24d测定大鼠神经功能损害评分,荧光显微镜下观察Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞在脑内的生存和迁移情况,采用免疫荧光法检测胶质原纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的表达。结果:①细胞移植后6d,12d骨髓间充质干细胞移植组大鼠的神经功能评分均显著低于磷酸缓冲液组(P<0.05)。②移植的骨髓间充质干细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移。③移植第24天Hoechst33342/微管相关蛋白2、Hoechst33342/胶质原纤维酸性蛋白双阳性细胞占Hoechst33342阳性细胞的百分率为(10.45±1.35)%,(8.73±1.38)%。结论:骨髓间充质干细胞可以在动脉闭塞局灶性脑缺血模型大鼠脑中存活,并向缺血区域附近迁移,在一定条件下可分化为神经元和星形胶质细胞,同时能促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复。     

骨髓间充质干细胞对大鼠生精上皮不同照射剂量放射性损伤的修复作用

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法，建立大鼠生精上皮放射性损伤动物模型，观察骨髓间充质干细胞对大鼠生精上皮放射性损伤的修复作用。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，建立大鼠放射性损伤动物模型。高剂量（2Gy）放射线照射组Wister大鼠20只，低剂量（0．5Gy）放射线照射组Wister大鼠20只，各组中随机取10只移植骨髓间充质干细胞作为实验组，剩余未移植大鼠10只作为对照组。取10只为经放射线照射大鼠作为正常对照组。照射2周和4周后取大鼠睾丸，切片染色镜下观察。结果高剂量照射组较低剂量照射组大鼠睾丸组织损伤明显加重，低剂量照射组实验组大鼠睾丸组织于移植后两周各级生精细胞基本恢复正常，移植后4周完全恢复与正常未照射组无明显区别。高剂量照射组实验组大鼠睾丸组织于移植后两周管腔内可见少量各级生精细胞，移植后4周管腔内各级生精细胞增多，可见成熟精子。各实验组恢复均好于对照组。结论大鼠骨髓间充质干细胞对生精上皮放射性损伤的修复可起重要作用。     

骨髓间充质干细胞移植人脑缺血大鼠侧脑室后的迁移及分化：免疫荧光标记

目的：骨髓间充质干细胞可以分化成神经细胞替代受损组织，并可分泌生长因子和营养因子来促进其体内细胞的存活和分化。实验将体外扩增和Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞移植入缺血性大鼠侧脑室内，观察干细胞在大鼠脑内的生存、迁移、分化情况及对神经功能恢复的影响。 方法：实验于2004—12／2007—06在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成。①取体质量120～160g的SD大鼠用于制备移植细胞；另取80只体质量250～300g的SD大鼠用于制作大脑中动脉闭塞模型。实验方法符合动物伦理学要求。②应用直接贴壁法分离纯化及扩增大鼠骨髓间充质干细胞，荧光染料Hoechst33342标记。③将造模成功的75只大脑中动脉闭塞大鼠按随机数字表法分为3组：模型对照组15只；磷酸缓冲液组30只；骨髓间充质干细胞移植组30只，将骨髓间充质干细胞立体定向移植到大鼠缺血侧脑室中。④术后1，3，6，12，24d测定大鼠神经功能损害评分，荧光显微镜下观察Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞在脑内的生存和迁移情况，采用免疫荧光法检测胶质原纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的表达。 结果：①细胞移植后6d，12d骨髓间充质干细胞移植组大鼠的神经功能评分均显著低于磷酸缓冲液组（P〈0．05）。②移植的骨髓间充质干细胞可在大鼠脑组织中存活，并向缺血区域迁移。③移植第24天Hoechst33342／微管相关蛋白2、Hoechst33342／胶质原纤维酸性蛋白双阳性细胞占Hoechst33342阳性细胞的百分率为（10．45±1．35）％，（8．73±1．38）％。 结论：骨髓间充质干细胞可以在动脉闭塞局灶性脑缺血模型大鼠脑中存活，并向缺血区域附近迁移，在一定条件下可分化为神经元和星形胶质细胞，同时能促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复。     

成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

目的:探讨成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性。方法:实验于2004-06/2005-06在中国医科大学实验动物中心完成,选取Wistar大鼠40只,4只用于骨髓间充质干细胞的培养;细胞移植组12只,磷酸盐缓冲液组12只,空白对照组12只。首先分离、培养及通过免疫细胞化学方法鉴定骨髓间充质干细胞,传代后经5溴脱氧尿嘧啶标记,采用局部注射的方法移植于Wistar大鼠脊髓全横断损伤区,移植后第7,14,28天通过免疫组化方法检测标记的移植细胞是否存活,并通过辣根过氧化物酶示踪技术检测损伤区域的轴突是否再生。结果:①原代骨髓间充质干细胞呈圆形,迅速贴壁,伸展,重新变为梭形或扁平型细胞。②免疫细胞化学染色显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD45呈阴性表达,CD90呈阳性表达。③成鼠骨髓间充质干细胞可由5溴脱氧尿嘧啶成功进行核标记,在采取局部注射的办法移植到损坏脊髓区域后可以检测到移植的细胞存活,光镜下5溴脱氧尿嘧啶标记的细胞呈棕黄色,以损伤区域为中心逐渐向头尾端迁移。④辣根过氧化物酶阳性反应物定位于神经元的胞浆,呈棕黄色颗粒,提示脊髓损伤处存在着轴浆运输以及轴突的再生,与对照组比较差别具有统计学意义。结论:骨髓间充质干细胞在移植后可存活于脊髓损伤区,并且促进轴突的再生。     

骨髓间充质干细胞移植多器官功能不全综合征兔心、肝、肺器官中凋亡因子Apaf-1的表达

背景:研究证明多器官功能不全综合征的发病及其器官组织损伤与细胞凋亡和坏死有关,而近年来骨髓间充质干细胞作为种子细胞在修复领域已初现成效.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对多器官功能不全综合征兔受累脏器组织细胞凋亡蛋白酶活化因子1表达的影响.方法:实验组建立两次打击多器官功能不全综合征动物模型,进行兔自体骨髓间充质干细胞体外培养、扩增、鉴定,慢病毒转基因标记GFP,经股动脉移植,并设立模型对照组及正常组.组织切片观察骨髓间充质干细胞在多器官功能不全综合征动物模型宿主内的存活情况,RT-PCR测定骨髓间充质干细胞移植前后凋亡因子Apaf-1在心、肝、肺垂要脏器中的表达.结果与结论:实验组兔肝、肺脏器组织内有慢病毒转基因标记GFP的骨髓间充质干细胞存在.RT-PCR结果显示正常组织心、肝、肺中均有Apaf-1 mRNA表达,且模型对照组心、脾、肾Apafi-1 mRNA表达较正常组明显增加,而实验组兔心、脾、肾组织中Apaf-1 mRNA表达下降.说明骨髓间充质干细胞具有良好的生物学活性,移植后的骨髓间充质干细胞能够定植在多器官功能不全综合征兔的受损脏器组织内,并下调Apaf-1 mRNA的表达,提示骨髓间充质干细胞移植有望为多器官功能不全综合征提供新的治疗方法.     

成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

目的：探讨成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性。 方法：实验于2004-06／2005-06在中国医科大学实验动物中心完成，选取Wistar大鼠40只，4只用于骨髓间充质干细胞的培养；细胞移植组12只，磷酸盐缓冲液组12只，空白对照组12只。首先分离、培养及通过免疫细胞化学方法鉴定骨髓间充质干细胞，传代后经5溴脱氧尿嘧啶标记，采用局部注射的方法移植于Wistar大鼠脊髓全横断损伤区，移植后第7，14，28天通过免疫组化方法检测标记的移植细胞是否存活。并通过辣根过氧化物酶示踪技术检测损伤区域的轴突是否再生。 结果：①原代骨髓间充质干细胞呈圆形，迅速贴壁，伸展，重新变为梭形或扁平型细胞。②免疫细胞化学染色显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD45呈阴性表达，CD90呈阳性表达。③成鼠骨髓间充质干细胞可由5溴脱氧尿嘧啶成功进行核标记，在采取局部注射的办法移植到损坏脊髓区域后可以检测到移植的细胞存活，光镜下5溴脱氧尿嘧啶标记的细胞呈棕黄色，以损伤区域为中心逐渐向头尾端迁移。④辣根过氧化物酶阳性反应物定位于神经元的胞浆，呈棕黄色颗粒，提示脊髓损伤处存在着轴浆运输以及轴突的再生，与对照组比较差别具有统计学意义。 结论：骨髓间充质干细胞在移植后可存活于脊髓损伤区，并且促进轴突的再生。     

局部注射骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤:运动功能有改善吗?

背景:目前研究多为骨髓间充质干细胞的体外培养及细胞移植对颅内疾病的治疗,对植入细胞在损伤脊髓中的成活、分化、迁移、结构重建等了解有限.目的:探讨局部骨髓间充质干细胞移植在脊髓损伤修复中的作用和骨髓间充质干细胞替代治疗的可行性.方法:成年健康雌性SD大鼠随机分为细胞移植组和对照组,建立SD大鼠脊髓横断损伤模型,伤后即刻分别向损伤区局部移植大鼠骨髓间充质干细胞悬液或无钙镁磷酸缓冲液.在术前和术后1 d,1周,2周,3周,4周和8周进行BBB评分,观测大鼠的运动功能,并于移植后1周免疫组织化学染色法观察BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处的存活情况,移植后4周进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测.结果与结论:移植后第1～8周细胞移植组BBB评分均高于对照组;术后1周免疫组织化学染色结果显示在细胞移植组大鼠脊髓远端检测到BrdU阳性细胞,术后4周脊髓损伤处发现有神经纤维.证实通过损伤后立即局部注射的方式将骨髓间充质干细胞移植进大鼠脊髓损伤区,细胞可在损伤区存活;存活的骨髓间充质干细胞可分化为神经元,在损伤局部形成神经元通路,从而促进脊髓神经纤维传导功能的恢复,并促进高位脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复.