针刺对肥胖模型大鼠下丘脑瘦素受体mRNA的表达与针刺的影响：SYBRGreen实时定量聚合酶链反应检测

背景：脂肪细胞合成的瘦素作用于下丘脑，引起食欲降低，能量消耗增加，导致降低体质量，减少体脂。但单纯性肥胖病患者由于瘦素抵抗导致肥胖。目的：观察针刺对肥胖大鼠血清瘦素含量和下丘脑瘦素受体OB—Ra和OB—Rb表达的影响，探讨针灸减肥的机制。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006—10／2007-01在南京中医药大学动物实验中心完成。材料：刚断乳的健康清洁级雄性SD大鼠90只，体质量50～70g。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。方法：随机挑选10只普通饲料喂养为正常组。另一组80只高脂致肥饲料喂养，将造模成功的肥胖大鼠30只随机分为肥胖模型组和针刺组，每组各15只。采用实时定量聚合酶链反应技术测定瘦素受体（OB—Ra，OB—Rb）基因表达水平，酶联免疫测定法测定血清中瘦素的含量。主要观察指标：针刺治疗前后肥胖大鼠体质量、血清中瘦素的含量以及下丘脑OB—Ra与OB—Rb基因表达的变化。结果：肥胖模型组大鼠体质量、血清瘦素水平均显著高于正常大鼠，而下丘脑OB。Rb基因表达水平均明显低于正常大鼠。针剌治疗取得良好减肥疗效的同时，针剌组大鼠血清瘦素明显回降，而下丘脑OB—Rb基因表达水平却明显升高。OB—Ra表达量3组差异无显著性意义。结论：针刺可改善肥胖大鼠瘦素抵抗状态以及促进下丘脑OB—Rb基因表达可能是针刺减肥的细胞分子重要机制。     

追赶肥胖大鼠血清瘦素水平及脂肪组织瘦素受体mRNA的表达变化

目的:通过观察大鼠追赶肥胖过程中瘦素水平及瘦素受体mRNA(OBRb-mRNA)表达变化进一步揭示追赶肥胖发生机制.方法:5周龄Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后随机分为对照组(NC)和追赶肥胖组(RN),NC组持续开放饮食,RN组给予半量饮食喂养4周(S4)后自由开放饮食8周.在造模过程中检测大鼠进食量、体重变化.分别于实验第0、4、6、8、12周采集血液并剥离内脏脂肪,测内脏脂肪(以两侧肾周及附睾脂肪为代表)重量/体重比值(以两侧肾周及附睾脂肪为代表);用ELISA法测血清瘦素水平及RT-PCR检测内脏脂肪OBRb-mRNA表达.结果:实验第4周,与NC组比较,RN组血清瘦素水平、内脏脂肪/体重比值明显降低(P＜0.05),内脏脂肪OBRb-mRNA表达增强,但无统计学意义.开放喂养后RN组血清瘦素水平、内脏脂肪/体重比值呈时间依赖性升高,于第8周时显著高于NC组(P＜0.05);而脂肪组织OBRb-mRNA表达逐渐降低,于第6周时明显低于NC组(P＜0.05).结论:在追赶生长过程中内脏脂肪组织OBRb-mRNA表达下降导致瘦素抵抗可能是造成内脏脂肪堆积的因素之一.     

针刺对肥胖大鼠瘦素和胰岛素含量的影响

目的：探讨针刺对肥胖机体瘦素和胰岛素含量及其血脑转运的作用。方法：将1月龄刚断乳SD雄性大鼠分为正常组、针刺组和对照组，观察针刺治疗前后肥胖大鼠体质量、体脂及中枢和外周瘦素和胰岛素水平的变化。结果：肥胖大鼠体质量、体脂及血清瘦素和胰岛素水平均显著高于正常大鼠，而下丘脑瘦素和胰岛素水平均显著低于正常大鼠。针刺治疗取得良好减肥疗效的同时，针刺组肥胖大鼠血清瘦素和胰岛素水平[(13．43&;#177;1．85）μg／L，(66．92&;#177;24．71)mIU／L]与对照组[(17．23&;#177;3．07)μg／L，(172．40&;#177;74．99)mIU／L]比较，均明显回降(P&;lt;0．05和0．01)，而下丘脑瘦素和胰岛素水平却明显升高(P&;lt;0．0l和&;lt;0．05)。大鼠体质量与血中瘦素呈显著正相关(r=0．677，P&;lt;0．01)；血清瘦素与胰岛素含量呈明显正相关(r=0．538，P&;lt;0．05)。结论：针刺对肥胖机体下丘脑和血中瘦素和胰岛素水平的良性调整作用可能是改善瘦素抵抗和胰岛素抵抗以及调整异常的内分泌代谢的一个重要环节。这种作用可能是针刺减肥的关键因素之一。     

瘦素受体基因GIn223Arg多态性与上海地区人群肥胖的相关性

目的：瘦素的体质量调节作用是通过瘦素受体介导的，分析瘦素受体基因GIn223Arg多态性与上海地区人群肥胖的相关性。 方法：于2003-09／2004-05选择解放军第二军医大学长海医院内分泌科门诊的超重和单纯性肥胖患者130例（诊断按照WHO标准：体质量指数≥25kg／m^2为超重，体质量指数≥30kg／m^2为肥胖），为肥胖组。选择同期参加门诊体检的正常对照者102例，为对照组。所有观察对象均为上海籍、汉族、无亲缘关系，且有完整临床资料。实验经医院伦理委员会批准，受试者均知情同意。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法测定受试者瘦素受体基因GIn223Arg多态性的基因型。 结果：①肥胖组和对照组瘦素受体基因GIn223Arg基因型的频率分布差异无显著性。②在肥胖组中，瘦素受体基因GIn223Arg多态性与体质量指数相关（P=0．036），携带G等位基因的肥胖患者体质量指数较高。③Logistic回归分析显示，该多态性与体质量指数独立相关（P=0．046）。 结论：实验结果提示，瘦素受体基因GIn223Arg多态性与上海地区人群肥胖相关。     

下丘脑瘦素对大鼠胃运动的作用

目的:观察下丘脑外侧区(LH)及腹内侧区(VMH)微量注射瘦素对大鼠胃运动的作用。方法:应用慢性植入应力传感器记录清醒大鼠胃体和胃窦运动,颈外静脉插管取血样品,血清瘦素用放射免疫分析法(RIA)测定。采用不锈钢管插入LH及VMH,供注射瘦素用。结果:大鼠胃运动类型:空腹胃体与胃窦出现典型的消化间期移行性复合运动(MMC),分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时相,其Ⅲ相高振幅收缩波可从胃体传至胃窦;下丘脑注射瘦素对胃运动的作用:下丘脑LH和VMH注射0.3、0.6、1.2μg/2μl瘦素均明显抑制大鼠胃体和胃窦MMCⅢ相收缩运动(均P<0.01),呈剂量反应效应。VMH与LH瘦素两者对胃运动抑制作用比较,VMH瘦素对MMCⅢ相收缩活动的抑制作用强于LH(P<0.05);下丘脑注射瘦素对外周瘦素影响:当给LH和VMH注射瘦素时外周血中瘦素浓度上升,与胃运动抑制同步。LH与VMH注射瘦素分别使血清瘦素较对照组增加(38.21±9.42)%(P<0.05)和(54.25±11.37)%(P<0.01);迷走神经和拮抗剂作用:切断膈下迷走神经,阿托品及胆囊收缩素A(CCK-A)受体拮抗剂loxiglumide均可阻断下丘脑瘦素对胃运动的抑制效应及外周释放瘦素的作用。结论:下丘脑瘦素对胃运动有持续性抑制作用,其作用可能通过迷走-胆碱能神经及CCK-A受体介导。     

饥饿大鼠脑杏仁核中瘦素受体的表达

背景：饥饿是脂肪代谢的一个重要过程，可触发适应性反应，瘦素水平下降，但饥饿时脑中瘦素受体是否变化及变化情况尚不清楚。目的：饥饿状态下瘦素受体表达的变化及杏仁基底外侧核和中央核的作用。设计：随机对照的实验研究。地点和材料：实验地点：西安交通大学医学院。成年健康雄性SD大鼠20只，随机分为禁食24，48，72h组和对照组，每组5只。干预措施：各组大鼠禁食前后分别检测体质量，体长，尾长。采用放免法测定血清瘦素水平，免疫组化ABC法检测瘦素受体和神经细丝酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达情况。主要观察指标：①各组大鼠体质量减少量，Lee指数，血清瘦素水平和血糖水平。②各组大鼠瘦素受体的表达。③各组大鼠星形胶质细胞GFAP的表达。结果：禁食24h血清瘦素由(2．49&;#177;0．60)μg／L下降至(1．26&;#177;0．97)μg／L，体质量减轻4．22％，48h和72h体质量分别减轻12．15％和19．70％，血清瘦素分别降至(0．78&;#177;0．19)μg／L和(0．62&;#177;0．16)μg／L。与正常大鼠相比，禁食24h杏仁基底外侧核瘦素受体表达增强[LR-IR细胞数(131&;#177;8．9)个／mm^2，(68&;#177;10．4)个／mm^2]，禁食48h瘦素受体表达水平(82&;#177;12．6)个／mm^2。接近正常大鼠，禁食72h瘦素受体阳性细胞明显减少(49．0&;#177;7．4)个／mm^2。杏仁中央核瘦素受体表达在禁食前后差异无显著性意义。禁食24h和48h杏仁基底外侧核GFAP染色阳性细胞数目与对照组大鼠比较差异无显著性意义。结论：饥饿时在血清瘦素水平下降时，杏仁基底外侧核瘦素受体表达上调。饥饿可能调节杏仁基底外侧核对瘦素的敏感性。     

运动对胰岛素抵抗大鼠瘦素及其受体表达的影响

目的观察运动对胰岛素抵抗大鼠血清瘦素水平及组织瘦素受体表达的影响。方法 9只SD大鼠普通饲料喂养作为对照组。将胰岛素抵抗造模成功的34只大鼠随机分为4组:模型组9只:高脂高糖喂养;二甲双胍组8只:高脂高糖喂养加用二甲双胍300 mg/kg.d;运动组9只:高脂高糖喂养加游泳运动;联合组8只:在运动组基础上加用二甲双胍300 mg/kg.d。6周后,测各组大鼠空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG),计算胰岛素抵抗指数(IRI);酶联免疫吸附法测定血清瘦素,免疫组化法检测肝脏、骨骼肌和脂肪组织中瘦素受体蛋白表达,RT-PCR法检测肝脏、骨骼肌和脂肪中瘦素受体mRNA表达。结果与模型组比较,二甲双胍组、运动组和联合组FPG、FINS水平降低,IRI升高(均P<0.05)。与对照组比较,模型组血清瘦素水平明显升高(P<0.01),肝脏、骨骼肌、脂肪组织中瘦素受体蛋白和mRNA表达均明显下调(均P<0.01);与模型组比较,二甲双胍组、运动组和联合组血清瘦素水平降低(P<0.05),瘦素受体蛋白和mRNA表达均上调(P<0.05)。与二甲双胍组比较,运动组和联合组瘦素受体蛋白及mRNA表达上调(均P<0.05)。结论胰岛素抵抗大鼠存在血清瘦素水平升高,组织瘦素受体表达下调。运动可以改善胰岛素抵抗,可能与降低血清瘦素水平,上调组织瘦素受体蛋白及mRNA表达有关。     

运动对糖尿病大鼠血清瘦素水平的影响

目的：探讨运动与血清瘦素水平的关系,观察不同运动量对糖尿病大鼠体质量、血糖、血清胰岛素和血清瘦素的影响。方法：将动物分成6组,分别为正常对照组、正常运动组、糖尿病组、糖尿病小运动量组、糖尿病中运动量组和糖尿病大运动量组。运动组按Ploug方法进行游泳训练。结果：正常运动组大鼠游泳8周后的血清瘦素浓度较运动前显著降低。运动前4个组的糖尿病组大鼠与正常对照组相比,体质量、血清胰岛素和血清瘦素水平显著降低,血糖浓度显著升高。游泳8周后只有糖尿病中运动量组大鼠的每周体质量增加数明显回升,血糖浓度较运动前降低35％,血清胰岛素浓度较运动前升高38％,血清瘦素浓度较运动前升高40％。而糖尿病小运动量组和糖尿病大运动量组大鼠运动8周后的上述指标与运动前相比无显著变化。多元相关回归分析,仅提示糖尿病大鼠血清胰岛素是血清瘦素有意义的影响因素。结论：正常生理状态下运动降低血清瘦素水平是机体为维持自身体质量稳定和能量平衡的一种适应性反应：而在链脲佐菌素（streptozotocin,STZ)糖尿病状态下,瘦素似乎与胰岛素关系更密切,中等强度运动在降低血糖,改善机体对胰岛素敏感性的同时,似乎也改善了对瘦素的敏感性;运动量不足或运动量过大对糖尿病均无明显治疗效果。     

瘦素受体基因Gln223Arg多态性与上海地区人群肥胖的相关性

目的:瘦素的体质量调节作用是通过瘦素受体介导的,分析瘦素受体基因Gln223Arg多态性与上海地区人群肥胖的相关性。方法:于2003-09/2004-05选择解放军第二军医大学长海医院内分泌科门诊的超重和单纯性肥胖患者130例(诊断按照WHO标准:体质量指数≥25kg/m2为超重,体质量指数≥30kg/m2为肥胖),为肥胖组。选择同期参加门诊体检的正常对照者102例,为对照组。所有观察对象均为上海籍、汉族、无亲缘关系,且有完整临床资料。实验经医院伦理委员会批准,受试者均知情同意。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法测定受试者瘦素受体基因Gln223Arg多态性的基因型。结果:①肥胖组和对照组瘦素受体基因Gln223Arg基因型的频率分布差异无显著性。②在肥胖组中,瘦素受体基因Gln223Arg多态性与体质量指数相关(P=0.036),携带G等位基因的肥胖患者体质量指数较高。③Logistic回归分析显示,该多态性与体质量指数独立相关(P=0.046)。结论:实验结果提示,瘦素受体基因Gln223Arg多态性与上海地区人群肥胖相关。     

A SYBR Green I-based real-time polymerase chain reaction assay for detection and quantification of canine bufavirus

Canine bufavirus (CBuV) was first discovered in puppies in Italy in 2016, and subsequent studies have reported its possible relationship with acute enteritis. Currently, there is no specific and quantitative detection method for CBuV. This study examined the conserved NS1 gene and used a pair of specific primers to establish a direct SYBR Green I-based real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method for the detection and quantification of CBuV. In the sensitivity experiment, the detection limit of SYBR Green I-based real-time qPCR was 4.676 × 10¹ copies/μL and that of conventional PCR (cPCR) was 4.676 × 10³ copies/μL. Furthermore, the qPCR method did not detect other viruses in dogs, indicating good specificity. The intra-assay coefficient of variation was 0.07–0.55% and the inter-assay coefficient of variation was 0.03–0.11%, indicating good repeatability. In clinical sample testing, the detection rate of qPCR was 5.0% (6/120), higher than that of cPCR (2.5%, 3/120). In addition, the samples that tested CBuV-positive in this experiment were all from dogs with acute enteritis. In summary, the SYBR Green I-based qPCR method established in this study has good sensitivity, specificity, and reproducibility for clinical sample detection and can also assist in future research on CBuV.     

人类Gfi1基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础.方法 以Gfi1基因为靶基因设计引物.构建携带GficDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品.应用ABI stepone PCR仪对Cfi1mRNA进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线.结果 建立了Cfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36×102～6.36×108copies/μl,线性相关系数y2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%.结论 本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测.     

SYBR Green实时定量PCR检测胰腺癌中HIF1α、VEGF和bFGF的表达及其临床意义

目的:研究胰腺癌及癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGFmRNA的表达情况及其临床意义。方法:利用实时荧光定量聚合酶链反应技术对22例胰腺癌细胞及其对应的癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGFmRNA进行定量检测,并分析其与临床病理特点之间的关系。结果:统计结果显示HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中的表达高于癌旁组织(P<0.01),相关性分析显示肿瘤组织中HIF-lα表达与VEGF、bFGF表达呈显著正相关(P<0.01)。HIF-1α表达与肿瘤大小和淋巴结转移显著相关(P<0.01),与TNM分期有关(P<0.05),与性别、年龄无相关性,VEGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关(P<0.05),bFGF高表达与肿瘤大小、淋巴转移淋巴转移相关(P<0.05),而与TNM分期、性别及年龄无相关性。结论:HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中存在高表达,HIF-1α表达与TNM分期、肿瘤大小和淋巴转移相关,VEGF和bFGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关。实时荧光定量PCR检测HIF-1α、VEGF和bFGF对评估胰腺癌患者预后可能有一定的价值,也为胰腺癌的治疗提供了治疗靶点。     

Establishment of a duplex SYBR green I-based real-time polymerase chain reaction assay for the rapid detection of canine circovirus and canine astrovirus

The similar clinical characteristics of canine circovirus (CaCV) and canine astrovirus (CaAstV) infections and high frequency of co-infection make diagnosis difficult. In this study, a duplex SYBR Green I-based real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was established for the rapid, simultaneous detection of CaCV and CaAstV. Two pairs of specific primers were designed based on the Rep gene of CaCV and the Cap gene of CaAstV. By using the real-time PCR assay method, the two viruses can be distinguished by the difference in melting temperatures, 79 °C and 86 °C for CaCV and CaAstV, respectively. This assay had high specificity, showing no cross-reaction with other common canine viruses, as well as high sensitivity, with minimum detection limits of 9.25 × 10¹ copies/μL and 6.15 × 10¹ copies/μL for CaCV and CaAstV, respectively. Based on the mean coefficient of variation, the method had good reproducibility and reliability. In a clinical test of 57 fecal samples, the rates of positive detection by real-time PCR were 14.04% (8/57) and 12.28% (7/57) for CaCV and CaAstV, respectively, and the rate of co-infection was 8.77% (5/57). In conclusion, the newly established duplex SYBR Green I-based real-time PCR assay is sensitive, specific, reliable, and rapid and is an effective tool for the detection of co-infections with CaCV and CaAstV.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的 建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值.方法 应用SYBR GreenⅠ作为荧光染料,以GAPDH作为内对照,建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法,并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测.结果 56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为1.07±2.99,阳性表达率为66.1%(37/56),30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为0.13±0.07,阳性表达率为6.7%(2/30),30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性;结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化(P＞0.05),但在Dukes C+D期表达水平(1.73±2.15)及表达阳性率82.8%(24/29)均显著高于Dukes A+B期表达水平(0.39±0.87)及表达阳性率48.1%(13/27)(P＜0.01).结论 该FQ-PCR方法简便、特异、可靠;检测外周血CEA mRNA表达水平,对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性,可提高早期结直肠癌诊断符合率;在发生转移的Dukes C+D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A+B期,可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一,动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（VQ-PCR）方法，探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值。方法应用SYBR Green J作为荧光染料，以GAPDH作为内对照，建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法，并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测。结果56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为1．07±2．99，阳性表达率为66．1％（37／56），30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为0．13±0．07，阳性表达率为6．7％（2／30），30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性；结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化（P〉0．05），但在Dukes C＋D期表达水平（1．73±2．15）及表达阳性率82．8％（24／29）均显著高于Dukes A＋B期表达水平（0．39±0．87）及表达阳性率48．1％（13／27）（P〈0．01）。结论该VQ-PCR方法简便、特异、可靠；检测外周血CEA mRNA表达水平，对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性，可提高早期结直肠癌诊断符合率；在发生转移的Dukes C＋D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A＋B期，可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一，动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值。     

SYBR GreenI染料法定量PCR检测疟原虫感染及鉴别虫种的临床应用

目的评价一种可以快速定量检测疟原虫及虫种鉴别的荧光定量PCR法。方法将SYBRGreenI法与TaqMan探针法检测疟原虫进行比对,评价定量的准确性及方法的敏感度。以PCR-DNA测序法为金标准,评价SYBRGreenI法分型的准确性。结果两个方法的定量拷贝检测数无显著性差异（P〉0．05）。SYBRGreenI法检测疟原虫的最低检测下限为1×10^2copy／mL至5×10^2copy／mL之间。与PCR-DNA测序法比较,SYBRGreenI法能准确的对感染的疟原虫虫种做准确的鉴定。结论SYBRGreenI染料法定量可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别,且成本低廉,操作简便快速,可以在疟疾的高发地区推广使用。     

Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction

We report a multiplex real-time polymerase chain reaction method for detecting enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) from strains or stool specimens. This assay detected the virulence genes stx1, stx2, and eae, without the use of probes. The method, which was validated on a collection of 143 EHEC strains, is simple, rapid, cost-effective, and sensitive.     

Simultaneous differentiation and diagnosis of goose parvovirus and astrovirus in clinical samples with duplex SYBR Green I real-time PCR

Two pairs of primers were designed to bind conserved genomic regions of goose parvovirus (GPV) and goose astrovirus (GAstV) to establish a simple, sensitive, and highly specific duplex quantitative PCR (qPCR) method to simultaneously detect the two viruses. The duplex qPCR can distinguish GPV (melting point: 82.1 °C) and GAstV (melting point: 79.8 °C) by the peaks of their individual melting curves. Mixed testing with other waterfowl viruses produced no nonspecific peaks. The established standard curves showed good linear relationships (R² > 0.997) and the limits of detection (LOD) for GPV and GAstV were 5.74 × 10¹ and 6.58 × 10¹ copies/μL, respectively. Both intra- and inter-assay coefficients of variation were <2%, indicating that the method has good repeatability. Twenty tissue samples from diseased geese were examined with the duplex qPCR assay and conventional PCR. Duplex qPCR showed positive rates of 25% for GPV and 45% for GAstV, and the positive rate for GPV and GAstV coinfection was 15%, slightly higher than the results for conventional PCR. These results indicated that this duplex qPCR method is highly sensitive, specific, and reproducible, and is suitable for epidemiological studies to effectively control the transmission of GPV and GAstV.     

Fast and sensitive quantitative detection of HIV DNA in whole blood leucocytes by SYBR green I real-time PCR assay

The aim of this study was the development of a real-time PCR for HIV DNA quantification in whole blood leucocytes providing an alternative assay to those already described, almost based on the gag gene detection. The technique (pbs-rtPCR assay) is more rapid (the whole assay required less than 5h), easy to perform, omitting both PBMC purification step and data normalization to a housekeeping gene, when compared to previously published assays. Our method is able to detect all group M HIV-1 subtypes in the highly conserved primer-binding site (PBS) region and to avoid the interference by retroviral endogenous sequences in HIV DNA quantification. The sensitivity was 100% for 2 copies even in the presence of high amounts of genomic DNA (1 microg). To monitor the HIV DNA level in all possible clinical conditions, the assay has been validated and compared with a previously developed gag-PCR assay on 73 HIV-1 HAART-treated patients with a plasma HIV-1 RNA range from <50 to >500,000 copies/ml. The 50% of the samples with a viremia below the limit of detection (50 copies/ml) was found to contain HIV DNA between 2 and 10 copies/microg DNA. The pbs-rtPCR offers a significant improvement in the percentage of quantitatively detectable sample (99%) compared with the gag-PCR (42%) suggesting caution in the choice of HIV DNA assay.