人喉癌细胞端粒酶催化亚基cDNA片段的扩增与克隆

目的 :测定人喉鳞状上皮癌 hep- 2细胞的端粒酶活性水平并获得 hep- 2细胞中 h TERT c DNA片段的克隆。方法 :采用 TRAP- ELISA法测定酶活性水平 ,RT- PCR技术扩增获得目的片段。利用酶切法、PCR法和序列分析法对所获克隆进行检测。结果 :hep- 2细胞具有较高的端粒酶活性水平 ,获得含h TERT c DNA片段的克隆。结论 :利用 RT- PCR法能够从具有较高端粒酶活性水平的 hep- 2细胞中扩增获得 h TERT c DNA片段     

端粒酶逆转录酶显性负突变体对乳腺癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的：观察端粒酶逆转录酶显性负突变体（DN-hTERT）对乳腺癌细胞MCF7端粒酶活性的抑制作用.方法：将携带DN-hTERT基因的真核表达载体IRES2-EGFP空载体通过脂质体2000介导转入MCF7细胞,以G418进行稳定筛选,得到阳性克隆;倒置荧光显微镜观察转染细胞的生长情况;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染细胞hTERT mRNA的表达;TRAP-ELISA方法检测转染细胞端粒酶活性.结果：MCF7细胞转染DN-hTERT后生长受到抑制;转染DN-hTERT的MCF7细胞（MCF7/DN）hTERT mRNA表达升高;改进端粒重复序列扩增法（TRAP-ELISA）检测MCF7/DN细胞端粒酶活性与转染空载体MCF7细胞（MCF7/I）比较显著降低（P＜0.05）.结论：DN-hTERT能特异性抑制MCF7细胞生长和端粒酶活性.     

三氧化二砷对Hela细胞hTERTmRNA表达的调节和对端粒酶活性的影响

目的：观察三氧化二砷(As2O3)对人宫颈癌细胞(Hela细胞)端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(hTERTmRNA)表达的影响。方法：以2μmoL／L的As2O3作用于人宫颈癌Hela细胞，在不同时间点用MTT法检测Hela细胞活力的变化，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，用RT-PCR法检测hTERTmRNA表达的变化，用TRAP-ELISA法检测端粒酶活性的变化。结果：随着As2O3作用时间的延长，Hela细胞的活力逐渐降低，G0／G1期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例减少，hTERTmRNA表达水平逐渐降低，端粒酶活性逐渐下降。结论：As2O3可引起Hela细胞周期阻滞，hTERTmRNA的表达水平下调，端粒酶活性降低。     

银染端粒重复序列扩增法定量检测端粒酶活性的研究

目的：探讨运用简便、快速及无放射性污染的银染粒重复序列扩增法（silver staining telomeric repeat amplification protocol,SS-TRAP）定量检测端粒酶活性。方法：运用SS－TRAP法检测了293细胞、经加热处理的293细胞、空白对照及典型乳腺癌组织、良性乳腺病变标本中端粒酶活性，其结果予以定量。结果：该法有检测出10个以上293细胞中端粒酶活性，热处理及空白对照均为阴性；乳癌组织标本中银染条带清晰可见，而良性病变中未见端粒酶阳性条带。结论：非核素银染TRAP法可用于端粒酶活性定量检测，与TRAP法相比，同样具有较高敏感性和特异性，但更快速、简便。     

慢病毒载体介导hTERT对肝细胞生物学特性的影响

目的：研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶（h-TERT）基因对人张氏肝细胞（chang liver）生物学特性的影响。方法：将表达h-TERT基因的重组慢病毒感染人张氏肝细胞,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。分别采用实时荧光RT-PCR、TRAP-PCR及ELISA方法检测转染前后chang liver细胞的h-TERT-mRNA水平和端粒酶活性的变化。通过MTT法、流式细胞术（FCM）观察其形态变化及生长增殖情况。结果：转染后的chang liver细胞存在h-TERT基因过表达和端粒酶活性上调,体外培养条件下维持肝细胞原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强。结论：外源性h-TERT基因的异位表达不仅上调chang liver细胞的端粒酶活性,而且促进其增殖。     

降低端粒酶表达对人喉癌细胞系Hep-2生长的影晌

目的：用表达端粒酶反义RNA的方法研究端粒酶在喉癌细胞生长中的作用。方法：将端粒酶反义RNA真核表达载体，pBBS212-hTR转染入人喉癌Hep-2细胞系中，采用端粒重复扩增法测定端粒酶活性，用MTT法及流式细胞仪检测细胞周期，并用电镜观察细胞生长状况。结果：端粒酶反义RNA表达后能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性，抑制细胞增殖并促进其凋亡.结论：以端粒酶反义RNA降低端粒酶的方法对人喉癌细胞系Hep-2的生长有明显抑制作用。     

Stable expression of antisense hTR inhibits in vitro pancreatic cancer cell growth

目的：为探讨抑制人端粒酶的模板RNA成分（hTR）能否抑制人胰腺癌细胞的端粒酶活性及细胞生长能力。方法：用分子克隆方法将593bp的hTR全长cDNA反向亚克隆到哺乳细胞表达载体pcDNA3.1（-）的多克隆位点上,以构建hTR反义表达质粒。酶切及序列分析证实此质粒为hTR反义表达质粒。此重组表达质粒与空质粒一起,通过脂质体法转导到人胰腺癌panc1细胞,并用G418筛选抗性克隆,所产生的稳定生长克隆用位于pcDNA3.1多克隆位点两侧的T7及GBH引物进行PCR扩增以证实外源hTR的存在。最后,对这些细胞的生长曲线、内源性hTR的表达、端粒酶活性及锚着非依赖性生长特性进行了分析。结果：转导有反义hTR重组质粒的人胰腺癌细胞与转导空载体及未转导任何质粒的对照细胞相比,Northern Blot及RT-PCR方法证实其内源性hTR的表达明显下调,TRAP方法证实其端粒酶活性明显下降。而且,其细胞增殖速度和软琼脂集落形成能力亦较对照组细胞明显减慢。但没有观察到明显的细胞衰老或凋亡现象。结论：上述结果表明hTR是人端粒酶复合物的关键组成部分,提示抑制端粒酶的hTR组分可能是抗肿瘤治疗的有效靶点。     

二甲基亚砜对CAOV3细胞端粒酶活性的可逆性抑制作用

目的探讨卵巢癌细胞CAOV3经二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）作用后及停止用药后端粒酶活性变化与细胞周期进展之间的关系。方法台盼蓝拒染法计数活细胞，流式细胞术观察细胞周期分布，端粒重复序列扩增法（TRAP）、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性。结果生长曲线显示DMSO对CAOV3细胞具有生长抑制作用，且具有浓度和时间依赖性。经1．4％DMSO作用96h后，CAOV3细胞主要受阻于G0／G1期，其端粒酶活性完全被抑制。去除药物后，细胞逐渐由G0／G1期向S期过渡，其端粒酶活性亦逐渐恢复，并于去除药物24h时，S期细胞百分率与端粒酶活性均明显高于用药前水平。结论DMSO对CAOV3细胞具有可逆性阻滞细胞周期进展，并下调其端粒酶活性的作用。CAOV3细胞端粒酶活性表达可能存在细胞周期依赖性调节。     

人胃癌组织端粒酶活性与其催化亚单位(hTRT)基因表达的相关性

[目的]探讨胃癌组织中端粒酶活性与其催化亚单位(hTRT)基因表达的关系.[方法]采用改良端粒重复扩增法(TPAP)和RT-PCR扩增法检测胃癌组织、胃溃疡组织、正常胃黏膜中端粒酶活性和hTRT基因表达.[结果]58例胃癌组织中51例(88%)有hTRT基因表达,50例(86%)检测到端粒酶活性,58例非胃癌组织中,3例有hTRT基因表达,无l例检测到端粒酶活性.[结论]hTRT基因表达与端粒酶活性的表达具有高度一致性.     

端粒酶逆转录酶基因修饰对人骨髓间质干细胞端粒酶活性的影响

目的:观察外源性端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的异位表达对人骨髓间质干细胞(MSCs)端粒酶活性的影响.方法:无菌条件下,抽取健康志愿者骨髓2 mL,经离心、洗涤及传代培养后备用.取第5代人MSCs接种至6孔培养板中,待其融合达90%～95%时,用脂质体法对其进行转染,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、pEGFP-C1质粒组、pEGFP-hTERT质粒组.选用G418进行抗性克隆的筛选.30 d后,正常对照组﹑脂质体组细胞全部死亡,而pEGFP-C1质粒组、pEGFP-hTERT质粒组则获得抗性克隆;将获得的抗性克隆进一步扩增后,选用pEGFP-C1质粒组、pEGFP-hTERT质粒组和未转染的人骨髓MSCs分别进行RT-PCR,检测转染前后hTERT mRNA的表达情况,并通过PCR-ELISA检测上述细胞的端粒酶活性.结果:未转染组和pEGFP-C1质粒组的人骨髓MSCs hTERT mRNA表达阴性,且端粒酶呈阴性;pEGFP-hTERT质粒组的人骨髓MSCs hTERT mRNA表达阳性,且端粒酶呈阳性.结论:外源性hTERT基因可以在人骨髓MSCs中获得异位表达,并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性.     

鼻咽癌组织端粒酶活性的表达

目的为探讨端粒酶在鼻咽癌发生发展过程中的作用。方法采用端粒重复片段扩增法（ＴＲＡＰ）对５０例鼻咽部组织标本进行端粒酶活性检测。结果鼻咽部慢性炎症、癌前病变组织端粒酶阳性率均为１００％,鼻咽癌端粒酶阳性率为８７．５％。本实验首次报道鼻咽部慢性炎症粘膜端粒酶活性表达较弱,但在癌前病变．鼻咽癌组织端粒酶活性明显增强,唯一１例高分化鳞状细胞癌检测不出端粒酶活性。结论从慢性炎症、癌前病变到鼻咽癌的演变过程中,端粒酶可能在癌前病变期激活,并在鼻咽癌的发生发展过程中起着重要作用。端粒酶活性可能与鼻咽部鳞状细胞癌的恶性程度有关。     

甲磺酸甲酯对CAOV3细胞端粒酶活性的影响

目的：探讨卵巢癌细胞CAOV3经烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)作用后端粒酶活性变化与生长状态之间的关系。方法：台盼蓝拒染法计数活细胞，噻唑蓝(MTT)法测定药物作用浓度，流式细胞术观察细胞凋亡，端粒重复扩增法(TRAP)、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性。结果：用药组与未用药组活细胞百分率无显著差异。MMS主要使CAOV3细胞受阻予S期，未见凋亡峰。用药组与对照组相出较端粒酶活性增强。结论：MMS对OWV3细胞端粒略活性有上调作用。CA0V3细胞对MMS的抗凋亡效应可能与端粒酶活性上调有关。     

外源性端粒酶催化亚单位对人视网膜血管内皮细胞的影响

目的探讨外源性人端粒酶催化亚单位(hTERT)对人视网膜血管内皮细胞(hRCEC)端粒酶活性、相关基因表达和体外生存时间的影响。方法阳离子脂质体介导hRCEC转染;RT-PCR法检测人类端粒酶RNA组份(hTR)、端粒酶相关蛋白1(TEP1)及hTERT基因的表达;TRAP法检测端粒酶活性;细胞计数法绘制生长曲线。结果hTR、TEP1基因在hTERT转染hRCEC前后都表达,hTERT基因在转染前不表达,转染后24h及稳定转染克隆形成时表达,细胞停止分裂时又失去表达;转染前无端粒酶活性,转染后24h及稳定转染克隆形成时可检测到端粒酶活性,细胞停止分裂时端粒酶活性消失;稳定转染了hTERT基因后hRCEC的生存时间没有延长。结论hTERT转染可显著提高hRCEC中hTERT基因表达水平,hTERT基因表达与端粒酶活性一致,但只用hTERT转染的方法不能使hRCEC细胞生存时间延长。     

细胞端粒酶活性的定性及定量分析

对Ｋｉｍ等的端粒重复序列ＰＣＲ扩增法加以改进，用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ染色代替ＥＢ染色，建立了细胞端粒酶活性的ＰＣＲ－ＴＲＡＰ定性分析法；同时，用γ－３２Ｐ－ＡＴＰ标记ＴＳ引物，加入内对照ＴＳＫ１，建立了ＰＣＲ－ＴＲＡＰ定量分析法。利用上述方法，对１２株人肿瘤或非肿瘤细胞株进行端粒酶活性分析，结果发现，所有被检细胞株均呈端粒酶阳性，但其活性水平在不同细胞株间有较大差异（２３～６５２ＴＰＧｕｎｉｔｓ）。作者认为，细胞端粒酶活性ＰＣＲ－ＴＲＡＰ分析法，特别是定量分析法的建立，为我们真实准确地了解细胞端粒酶活性水平提供了可能，亦为下一步通过抑制端粒酶活性诱迫肿瘤细胞进入程序性死亡的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

反义端粒酶RNA抑制肝癌细胞生长的机制

目的：观察反义端粒酶RNA对SMMC－7721肝癌细胞系的作用,探讨抗端粒端治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法：采用脂质体介导的方式将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTP转入SMMC7721细胞中,经潮霉素筛选,克隆细胞株扩增鉴定后,采用TRAP－PCR－ELISA,FCM及电镜检测反义端粒酶RNA对转染细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响;同时进行裸鼠荷瘤生长实验观察。结果：TRAP－PCR－ELISA法检测细胞端粒酶活性的结果为：实验组吸光度值为0．980,对照组吸光度值为2．861;FCM检测细胞凋亡结果为：实验组13．8％,对照组未见有凋亡峰形成,电镜观察发现转染细胞表现出典型的凋亡细胞形态。裸鼠移植瘤生长实验发现,转染细胞生长明显受到抑制作用,说明反义端粒酶RNA显抑制SMMC7721细胞的端粒酶活性,并且对其有显的促凋亡作用。结论：反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性,同时显促进癌细胞凋亡。     

端粒酶hTERT基因反义核酸对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响

目的 探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响.方法 采用TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平;以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化.结果 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)作用于T24细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制.结论 通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)特异性抑制hTERT基因mRNA的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性.     

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

目的通过反义技术抑制肺腺癌A549细胞T-STAR (testes-signal transduction and activator of RNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响.方法用阳性脂质体法将T-STAR反义基因转染入A549细胞,用RT-PCR及Western blot方法检测转染细胞内源性T-STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性改变.结果反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A549 T-STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性.结论肺腺癌A549细胞T-STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性.     

急性白血病不同病期端粒酶活性及其预后意义初探

目的：观察急性白血病（AL）不同病期端粒酶活性及其与AL预后的关系。方法：用端粒重复扩增酶联免疫法进行端粒酶活性半定量测定。结果：（1）初发AL端粒酶活性与首次完全缓解（CR）期无显著差异而与CR期超3个月者差异显著；（2）CR3个月后持续高端粒酶活性提示缓解期短，预后不佳。结论：CR3个月后端粒酶活性可作为预后判定指标之一，而发病前端端酶活性与预后无关。     

癌性胸水脱落细胞端粒酶活性表达初步研究

目的：建立银染－ＴＲＡＰ法检测胸水脱落细胞端粒酶活性，探讨银染－ＴＲＡＰ法用于胸水，脱落细胞中端粒酶活性研究的可行性。方法：应用银染－ＴＲＡＰ法检测３０例癌性胸水脱落细胞和３０例结核性胸膜炎胸水脱落细胞端粒酶活性的表达。结果：癌性胸水脱落细胞端粒酶活性为１００％（３０／３０）表达，对照组胸水脱落细胞端粒酶活性为阴性（Ｐ＜０．０１）。结论：癌性胸水脱落细胞中存在端粒酶活性；端粒酶活性与癌性胸水的形成原因有关；银染－ＴＲＡＰ法是一种敏感、可靠且简便、快速和经济的方法，适用于临床实验室进行大规模的样本筛选。