PCR-ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA

目的　采用PCR ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA。方法 采用PCR技术扩增结核杆菌DNA，并将扩增产物加入预先包被结核杆菌探针的微孔板，再加入结核杆菌显色探针，同时进行微孔板核酸夹心杂交ELISA显色。共检测肺部疾病患者痰标本 510例。结果 该法的灵敏度为 59.3%，特异性为 95.0%；阳性预测值为 96.3%，阴性预测值为 51.4%。结论 PCR ELISA微孔板杂交技术可快速、准确地检测结核杆菌DNA，是结核病早期诊断和鉴别诊断的可靠实验室方法。     

微孔杂交技术诊断肺外结核

目的 将聚合酶链反应（ＰＣＲ）、核酸杂交、酶联免疫吸队中技术有机结合，从分子水平检测结核杆菌，为临床诊断肺外结核提供病原学依据。方法 使用生物素标记的特异性引物扩增结核杆菌（ＴＢ）ＤＮＡ，带有生物素的产物与包被在微孔板内的靶基因杂交，加入酶标链毒亲和素与生物素结合，最后加辣根过氧化物酶显色，２Ｍ Ｈ２ＳＯ４终止反应。根据酶标仪检测各孔吸光度判断结果。结果 通过对临床高度怀疑为肺外结核的４０８份标本     

rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌的研究

目的 应用结核分枝杆菌特异的rDNA探针杂交检测痰标本中的结核杆菌rDNA,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物b对结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列进行扩增,同时加入生物素标记,制成250bp的rDNA探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究,并对90份结核病人,30份非结核病人痰标本的PCR产物进行了斑点杂交检测。结果 rDNA探针检测引物bPCR扩增产物的敏感性为100pg。rDNA探针与受试24种分枝杆菌和11种非分枝杆菌引物bPCR扩增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝杆菌为阳性杂交,特异性较高。而rDNA探针对90份结核病人痰标本引物b扩增产物检测的阳性率为80.2%,高于PCR扩增产物电泳检测结果 (64%)。rDNA探针与30份非结核病人痰标本杂交结果均为阴性杂交。结论 rDNA探针与引物bPCR扩增相结合能提高结核病人痰标本检测的敏感性与特异性。     

聚合酶链反应-增强化学发光法快速检测结核杆菌的研究

目的　建立聚合酶链反应 -增强化学发光法 (polymerase chain reaction-enhanced chemilumine cence ,PCR-ECL)快速高灵敏度和高特异性检测结核杆菌的方法。方法 以结核分支杆菌、牛分支杆菌特异性抗原Pab基因的419bp片段为靶序列,PCR体系经优化,直接酶标法标记探针 ,增强化学发光检测(ECL)进行分子杂交。结果 PCR体系对结核分支杆菌、牛分支杆菌、卡介苗的扩增为阳性,PCR体系灵敏度为5fgDNA分子。ECL体系灵敏度为0.5pgDNA分子。采用模拟痰样,可检至10个以下结核杆菌。结论 建立了结核杆菌的PCR-ECL快速检测方法,整个过程可在一天半内完成。     

荧光探针杂交技术检测临床标本内结核分支杆菌的价值

目的　评价聚合酶链反应(PCR)荧光探针杂交技术(TaqMan技术)检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法 应用细菌学方法(涂片镜检和培养)及TaqMan法检测133份结核病患者痰标本,53份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果 细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为36.1%,TaqMan法阳性率为61.7%,高于细菌学检测法,经统计学处理,两者有显著性差异(P<0.05),用TaqMan法检测临床标本特异性为96.2%。结论 TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性较高等优点,是结核病辅助诊断的有效方法之一。     

4种方法联合检测在菌阴肺结核临床诊断价值的研究

目的　探讨痰聚合酶链反应——微孔板杂交技术(PCR ELISA)、抗脂阿拉伯甘露糖(LAM-IgG)抗体、结核菌素(PPD)1TU皮试以及血清可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)水平,4种方法联合检测对初治菌阴肺结核患者临床诊断的意义。方法 以上述4种方法检测初治菌阳肺结核57例,初治菌阴肺结核58例,非结核肺疾病41例,健康对照36例。分别进行单项与联合检测,观察初治菌阴肺结核的特异性与敏感性。结果 PCR-ELISA、LAM-IgG、TB-PPD及sIL-2R单项检测对菌阴肺结核的阳性检出率依次分别为 43.1%,37.9%,31.0%,50.0%。联合检测对菌阴肺结核的阳性检出率2联、3联及4联依次分别为 56.9%,70.7%,84.5%,与单项检测的最高阳性检出率相比由50.0%提高到84.5%;联合检测的特异性分别为92.2%,88.3%和84.4%。结论 通过4种方法联合检测能显著提高菌阴肺结核的阳性检出率,同时也保持了相对高的特异性。联合检测对于菌阴肺结核的诊断,具有实用意义。     

结核分支杆菌镜检、培养和PCR技术诊断结核病的临床评估

目的　评估结核分支杆菌PCR、培养、镜检对结核病诊断的临床效果。方法 对1217例临床可疑结核病人用PCR、培养和镜检三种方法的阳性检出率进行比较。结果 不同临床标本用PCR技术诊断结核病,其敏感性高于培养和涂片镜检,阳性检出率分别为:88.7%,43.4%,26.5%。结论 通过三种方法比较分析,说明PCR技术是一种速度快、检出率高的检测结核分支杆菌的重要方法,对结核病的诊断有重要的参考价值。     

TB-SA抗体检测对结核病临床诊断价值的研究

目的　对TB-SA(Tuberculosis-Specific Antigen)抗体检测用于结核病诊断的价值进行评估。方法 2004年5—11月在山东省胸科医院住院的活动性结核病患者230例(菌阳肺结核60例,菌阴肺结核131例,肺外结核39例),非结核呼吸系统疾患者96例,无结核疾患的在校大学生健康志愿者41人,入选病例留取的痰、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液标本同时进行抗酸杆菌浓缩集菌,结核杆菌培养,血清样本进行TB-SA抗体检测。结果 活动性结核病人血清学检测TB-SA抗体总的敏感性为67.8%。活动性肺结核敏感性为67.6%,肺外结核敏感性为59.0%(P>0.05);诊断结核病总的特异性为76.6%,在非结核呼吸系统疾患中为72.9%,在健康人群中为85.4%。结论 TB-SA抗体检测是一种快速、简单、有较好敏感性和特异性的结核病辅助诊断手段,对菌阴肺结核及不易取得细菌学检查标本的肺外结核病、儿童结核病有较高的参考价值。     

结核抗体等5项检测指标不同联合对复治肺结核诊断价值的研究

目的　探讨结核抗体、C反应蛋白(CRP)、血红细胞沉降率(ESR)、结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)皮肤试验、分枝杆菌聚合酶链反应(PCR)检测不同联合对复治肺结核诊断的临床价值。方法 结核抗体采用金标法,PCR检查采用荧光双标记定量法,ESR采用魏氏法,CRP采用免疫浊度法,结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)皮肤试验按照国家规定。结果 5项检查的单项敏感性依次为PCR(92.0%)、结核抗体检测(81.3%)、ESR(80.0%)、PPD(68.3%)、CRP(66.7%);特异性依次为94.0%、87.0%、32.0%、72.0%、75.0%。任意联合其中2项检测指标的结果对复治肺结核诊断的敏感性明显上升;结核抗体与PCR联合检测的诊断特异性与其他联合相比更有价值(P<0.05)。联合3项及3项以上的检测指标敏感性达到或接近100.0%,但其特异性与PCR和结核抗体联合检测相比反而下降明显(P<0.01)。结论 在结核抗体、ESR、CRP、PPD、PCR等5项检测指标中,联合检测结核抗体与PCR对复治肺结核的诊断最有价值,在此基础上增加检测项目并不能提高对复治肺结核的诊断价值。     

结核蛋白芯片对肺结核诊断的临床价值

目的　探讨结核蛋白芯片、痰涂片抗酸染色及结核菌素(PPD)皮试单独和联合检测对肺结核患者临床诊断的意义。方法 对45例肺结核和30例非结核性肺疾病患者,同时进行结核蛋白芯片、痰抗酸杆菌直接涂片、PPD皮试,观察单项和联合指标对诊断肺结核的敏感性与特异性。结果 结核蛋白芯片、PPD及痰涂片的敏感性分别为66.7%、44.4%、22.2%,特异性分别为93.3%、84.6%、100%。结核蛋白芯片联合PPD对肺结核的阳性检出率为86.7%,结核蛋白芯片联合PPD及痰涂片的阳性检出率提高到88.9%,与单项检测的最高阳性检出率相比差异有显著性意义(P<0.05)。三种方法联合检测的特异性为80%,与PPD或结核蛋白芯片单项检测相比无显著性差异(P>0.05)。结论 结核蛋白芯片是诊断结核病较有效方法,具有快速方便等优点,蛋白芯片联合PPD、痰涂片抗酸染色,能显著提高肺结核的阳性检出率,但特异性并没有明显下降。     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

寡核苷酸探针膜杂交法检测耐药结核菌

目的应用寡核苷酸探针膜杂交法快速检测临床分离株中结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)的耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌3种药物常见耐药基因的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交。结果26株耐INH菌株中,16株Klb杂交阳性;7株inhla杂交阳性;23株耐SM菌株中,17株rpsl基因突变型探针Slb杂交阳性,2株突变型探针rrslb杂交阳性;31株耐EMB菌株中,13株Elb杂交阳性,1株Elc杂交阳性,5株Eld杂交阳性,1株Ele杂交阳性,11株与El探针杂交。kagG、inhA、rp-sL、rrs和embB基因膜杂交突变检出率分别为61.5%,26.9%,74%,8.7%和64.5%,与PCR-DS分析结果一致。结论寡核苷酸探针膜杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌耐药基因型简便、快速的方法。     

三种快速检测结核分支杆菌方法的评价

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术、单克隆抗体（ＭｃＡｂ）ＴＢ１５－Ｃ＿３经酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及抗酸染色等３种方法，对１０种抗酸杆菌及２种非分支杆菌进行检测。ＰＣＲ仅对结核分支杆菌复合体扩增出２４５ｂｐ特异性条带，ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ检测除人型结核分支杆菌外，还与ＢＣＧ、鸟型及瘰疬分支杆菌反应阳性，抗酸染色则所有分支杆菌均呈阳性。用ＰＣＲ、ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ及抗酸染色检测了１２４份临床标本，ＰＣＲ的检出率高于抗酸染色涂片的阳性率（Ｐ＜０．０５），ＭｃＡｂ－ＥＬＩＳＡ检测阳性率明显高于抗酸染色涂片和ＰＣＲ的阳性率（Ｐ＜０．０１）。认为三种方法在使用中各自有其优点，不可偏废。     

结核性腹膜炎的实验室诊断

目的评价聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对结核性腹膜炎的诊断价值。方法用ＰＣＲ结合地高辛标记核酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术检测４２例结核性腹水中结核分支杆菌ＤＮＡ，并与常规细菌学检测及ＥＬＩＳＡ对比。引物来自结核分支杆菌特异重复插入序列ＩＳ６１１０。特异性通过杂交及限制性内切酶ＳａｌⅠ酶切证实。同时比较了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测与凝胶电泳检测的敏感性。结果ＰＣＲ的敏感性为６９％，ＥＬＩＳＡ为７１％，培养为９％，涂片镜检均为阴性。并发现杂交较凝胶电泳检测更敏感。结论ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ法对结核性腹膜炎有较高的诊断价值，但前者更具有特异性。将Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术与ＰＣＲ技术结合，可进一步提高检测的敏感性和特异性。     

聚合酶链式反应与DNA探针检测临床标本中结核分支杆菌的评价

本文应用ＰＣＲ联合ＤＮＡ探针快速检测临床标本中结核杆菌ＤＮＡ。对临床３０７例标本同时进行ＰＣＲ和Ｓｏｕｅｈｅｒｎ杂交。其中临床确诊为结核病的１０９例，二者的阳性率分别为４９．６％、６０．６％。未确诊结核病的１９８例，二者均为阳性２例、单纯ＰＣＨ阳性３例。结果表明ＤＮＡ探针检测的灵敏性和特异性高于ＰＣＲ。二者联合使用，有助于对疑难电泳图谱的分析和判断，降低假阴性和假阳性率。     

应用反向斑点杂交法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。     

AmpliSensor—聚合酶链反应定量检测肺结核患者外周血结 …

目的 探讨ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应定量检测外周血中结核分支杆菌ＤＮＡ在肺结核的应用价值。方法 采用ＱｌＡａｍｐ和ＡｃｕＰｕｒｅ法提取，制备全血中模板ＴＢ－ＤＮＡ，应用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ定量检测，并与ＩＳ６１１０－单管巢式聚合酶链反应（ＳＮ－ＰＣＲ）作比较。结果２００例肺结核患者的血液标本中，两种方法测得结核分支杆菌ＤＮＡ的阳性率分别为６０．５％、６３．５％。８５例非结核肺病     

用DNA 芯片快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：研制一种新型DNA芯片，用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测，方法：根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片，PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段，与芯片杂交，同时以DNA测序法为对照，结果：17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有14株可用DNA芯片检测出来，效率可达83％，患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测，无须进行培养。结论：用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度，该法快速，精确，可以应用于临床耐药性检测。     

应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究

目的根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株。结果分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交。应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符。结论应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值。