HEV ORF3真核表达载体的构建、鉴定和真核表达

目的构建表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3-pXF2RH融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的L02细胞系。方法利用PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断,HindⅢ/EcolⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pXF2RH真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒ORF3-pXF2RH。将阳性克隆用脂质体法转染L02细胞系,G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定ORF3-pXF2RH融合蛋白的表达。结果真核表达质粒转染L02细胞,SDS-PAGE显示在28.5kD左右蛋白表达量明显高于对照组,Western blot在28.5kD左右有一条强的棕色条带。结论成功构建ORF3-pXF2RH真核表达质粒,在L02细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。     

戊型肝炎病毒ORF3和标签His融合真核表达载体的构建与表达

目的体外构建HEV ORF3蛋白融合His标签的真核表达载体及其初步鉴定和蛋白表达。方法从1例男性31岁戊型肝炎患者血清中分离HEV RNA,逆转录合成cDNA,特异性引物扩增HEV ORF3片段,将其定向连接到pcDNA3.1(-）-His真核表达载体中,经抗生素筛选后,酶切及测序鉴定其序列正确性。采用提取质粒转染HepG2细胞,培养96 h后裂解细胞,采用抗His-Tag抗体进行Western blot检测目的蛋白。结果从戊型肝炎患者血清中成功分离出I型HEV RNA,经抗生素筛选、酶切鉴定和测序确认pcDNA3.1(-）-HEF3-His真核表达载体构建成功,转染HepG2细胞,经Western blot检测显示15 kDa位置有明显融合蛋白条带。结论成功构建了HEV ORF3与His标签融合的真核表达载体,体外转染HepG2细胞后鉴定其工作良好,为后续HEV ORF3蛋白的研究奠定了基础。     

pCMV-HSF2-FLAG重组质粒的构建及其在Caco-2细胞中的表达

目的:构建人HSF2 pCMV-Myc真核表达载体,研究其在人结肠上皮肿瘤细胞Caco-2内的表达和定位.方法:以HSF2 Human cDNA ORF clone为模板,PCR法扩增出全长HSF2编码系列,用EcoRⅠ和KpnⅠ对HSF2 PCR纯化产物双酶切后,采用基因重组技术将其插入至pCMV-Myc载体中.DNA测序正确后,脂质体法将重组质粒转染到Caco-2细胞内,提取细胞总RNA逆转录为cDNA后进行普通PCR检测HSF2 mRNA转录水平,提取细胞蛋白进行Western blot检测HSF2蛋白质水平及融合蛋白表达.采用激光共聚焦显微镜观察HSF2及融合蛋白在Caco-2内的表达和定位.结果:将人全长HSF2编码序列克隆到真核表达载体pCMV-Myc中,酶切鉴定片段为1557bp,重组质粒测序正确.转染重组质粒后,PCR显示HSF2在mRNA水平较未转染组和空载组升高;Western blot检测到融合蛋白正确表达,分子量约为70kDa.与未转染组和空载组相比,重组质粒组HSF2蛋白质水平明显升高.激光共聚焦显微镜下观察到HSF2和融合蛋白定位一致,主要分布于Caco-2细胞质中,少量聚集在细胞核膜.结论:成功构建了人全长HSF2编码序列的pCMV-HSF2-FLAG真核表达载体,并在Caco-2细胞中成功表达,为进一步研究HS F2在溃疡性结肠炎中的作用奠定了良好的基础.     

HEV ORF3真核表达载体的构建

目的 构建戊型肝炎病毒（HEV） ORF3真核表达载体pcHEV3并进行初步鉴定.方法 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中提取HEV RNA,逆转录法合成HEV cDNA,采用RT-PCR方法扩增HEV ORF3 cDNA片段,将其克隆至载体质粒pcDNA3,构建HEV ORF3真核表达载体,经抗生素初步筛选后,重组阳性载体进行酶切和测序鉴定.结果 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中克隆出HEV ORF3全长cDNA片段,经酶切鉴定及DNA测序鉴定,成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体pcHEV3.结论 成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体,为进一步研究HEV ORF3蛋白的功能提供了条件.     

人载脂蛋白C Ⅱ原核表达载体构建及蛋白表达方法

目的 构建人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）的原核表达载体,表达融合蛋白GST-hApoCⅡ.方法 采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切pUC18/hApoCⅡ获得ApoCⅡ成熟肽基因片段,并与相同酶切处理的表达载体pGEX-3X连接构建重组质粒.重组质粒经酶切鉴定、测序验证后转化感受态E.coli DH5α,IPTG诱导表达,优化表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳分析鉴定.选取最佳条件诱导表达,亲和层系法纯化融合蛋白,采用Western blot鉴定.结果 重组质粒经酶切和测序后证实目的基因已连接入表达载体,SDS-PAGE检测到35 kD的目的蛋白条带,优化和纯化后经Western blot证实蛋白质产物为融合蛋白GST-hApoCⅡ.结论 本方法成功表达融合蛋白GST-hApoCⅡ,此为ApoCⅡ结构及其作用机理研究及制备ApoCⅡ抗体等提供了便利条件.     

蛋白激酶SGK3基因的克隆及其在乳腺癌细胞中的表达

目的探讨通过克隆蛋白激酶(SGK)3基因并将其转染乳腺癌MCF-7细胞建立高表达SGK3的MCF-7细胞系的稳态性。方法利用真核表达载体N-端增强型绿色荧光蛋白(p EGFP-N1)通过基因克隆技术构建重组质粒,通过菌落PCR和DNA测序方法对重组质粒进行鉴定。通过PEI介导将重组质粒p EGFP-N1-SGK3转染至乳腺癌MCF-7细胞中,荧光显微镜和Western印迹方法对基因转染效率以及融合蛋白GFP-SGK3的表达进行鉴定。结果成功构建了真核表达质粒,将其命名为p EGFP-N1-SGK3;在荧光显微镜下可见多数细胞发出绿色荧光,表明获得了较高的转染效率;Western印迹结果显示,在转染p EGFP-N1-SGK3的细胞中可见阳性条带,而MCF-7亲本细胞和转染空载体的对照组细胞无阳性条带。结论成功构建了重组质粒p EGFP-N1-SGK3,获得了稳定表达融合蛋白GFP-SGK3的MCF-7细胞系,可用于后续SGK3细胞内功能的研究。     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的 研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术，将真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B和空载体pcDNA3．1分别转染Hela细胞，400μg／ml G418加压筛选和200gg／ml G418维持筛选，获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和Western-blot方法对复合基因P30P22-CTXA2／B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示，重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku，Western blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3，1-P30-P22-CTXA2／B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白，为进一步动物实验提供了实验依据。     

大鼠髓样细胞表达激发受体-1／人IgG融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定

目的 构建大鼠髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）/人IgG融合蛋白的真核表达载体,并在家蚕Bm细胞中实现稳定表达。方法 克隆大鼠TREM-1胞外段与人IgGFe段,片段连接后PCR扩增,再与病毒穿梭载体BAC1连接,基因克隆,构建重组质粒。利用杆状病毒表达系统（Bar-to-Bar）筛选重组杆状病毒,在Bm细胞中进行融合表达,并用Western blot法行蛋白鉴定。结果 重组质粒酶切测序正确,确认克隆载体构建成功。Western blot结果说明该蛋白样品可被抗大鼠TREM-1抗体特异性识别,证明该蛋白为TREM-1/IgG融合蛋白。结论 成功构建了大鼠TREM-1/IgG融合蛋白真核表达载体,并在Bm细胞中稳定表达。