EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒(EBV)LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽.方法 利用亲和层析柱加酶切的方法 纯化CTAR23蛋白,并用其筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力.通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果.ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果 显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS.结论 噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础.     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

胃癌相关抗原MG7-Ag模拟肽表位的筛选及测序分析

目的　从噬菌体呈现的随机肽库中筛选胃癌单克隆抗体MG7所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位 ,为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。方法　用胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的 2个九肽库分别进行亲和富集和免疫筛选 ;阳性克隆进一步用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹法证实其结合活性 ;经随机抽取部分阳性克隆进行DNA序列分析 ,推导出相应噬菌体呈现肽的氨基酸序列 ,通过序列比较分析相对保守的表位信息 ;运用HLA分子结合分析软件预测已测序短肽与HLA分子结合的可能性。结果　经反复多轮筛选和结合活性检测 ,从pⅧ和pⅧ cys 2个噬菌体肽库中分别得到了 12和 30个阳性克隆 ;通过对部分阳性克隆进行测序分析 ,推导相应的随机肽序列和序列比较分析 ,得到具有相对保守性的表位信息如PLX0 2 S、SAVR、XRMX、YARN等。经计算机预测分析 ,发现它们可与HLA多个分子结合。结论　PLX0 2 S、SAVR、XRMX、YARN等有可能为胃癌单克隆抗体MG7所识别的表位基序。     

应用噬菌体展示技术筛选缺氧诱导因子-1α相关肽

目的：应用噬菌体展示12肽库筛选低氧诱导因子—α(HIF—α)相关肽。方法：以抗HIF—α单克隆抗体(HIF—αmAb)为配基，采用亲和免疫法从随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体。在筛选过程中，逐轮提高HIF—αmAb的稀释度并增强洗脱强度。3轮筛选后，随机挑取10个克隆测序。通过膜斑点印迹(Dot-ELISA)进行特异性结合鉴定。结果：经过3轮筛选后，特异性结合的噬菌体得到有效的富集，并且Dot-ELISA反应阳性逐轮增强。测序后发现有4个克隆的序列完全相同，其12肽氨基酸序列为GPHHYWYHLRLP。结论：噬菌体展示肽库技术可以用于筛选HIF—1相关肽，并为后续的活性鉴定打下基础。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

利用噬菌体肽库筛选Survivin结合肽

目的：将纯化的Survivin蛋白作为诱饵,从噬菌体肽库中筛选出结合肽。方法：用纯化的Sur-vivin蛋白包被35 mm的塑料培养皿,加入随机12肽的噬菌体肽库,用靶分子溶液竞争性洗脱结合的噬菌体,通过测定噬菌体滴度检测Survivin蛋白的吸附、富集效果,筛选阳性噬菌斑,制作DNA测序模板进行测序。结果：经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果。从第3轮筛选产物中挑取8个蓝色噬菌斑（阳性克隆）进行测序,DNA测序结果表明,具有一致性序列GIANNFFTLKIS。结论：从噬菌体随机肽库中,筛选到能与Survivin蛋白特异性结合的一段短肽,为Survivin蛋白的进一步研究奠定基础。     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

天花粉蛋白结合肽的筛选及潜在靶点蛋白的同源分析

目的 通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法 用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的亲和力,对阳性克隆进行测序,并将多肽序列与已登记蛋白序列进行同源性分析。结果 每轮筛选的回收率,及多克隆噬菌体ELISA结果显示筛选有效。通过单克隆噬菌体ELISA结果挑取阳性克隆,测序分析得到若干噬菌体展示多肽序列。经蛋白质同源性分析,TCS特异性结合多肽与蛋白激酶C（PKC）的磷酸化位点具有同源序列。结论 噬菌体展示技术是筛选中药成分靶点蛋白的有效手段,PKC可能为TCS潜在的靶点蛋白。      

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础     

恶性疟原虫EBA-175与血型糖蛋白A结合位点的鉴定

目的 探索EBA-175与GPA之间的结合信息,为疟疾短肽疫苗及拮抗药物的研制奠定基础.方法 以EBA-175重组蛋白为靶,采用亲和筛选法对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选,通过ELISA、竞争抑制试验、Dot-ELISA及Western blotting等方法鉴定获得的噬菌体短肽与EBA-175之间的结合特性.对阳性克隆进行DNA序列测定,推导其十二肽的氨基酸序列并与GPA氨基酸全序列进行了同源性比较.结果 经3轮亲和筛选后,结合噬菌体得到良好富集.从第3轮洗脱液铺制的琼脂板中随机挑取30个噬菌体单克隆,ELISA检测有27个为阳性,阳性率达90%.竞争性ELISA显示多数阳性噬菌体能竞争抑制EBA-175与其单抗结合.DNA及氨基酸序列分析表明24个噬菌体展示十二肽中共有序列IRR与GPA的114-116位氨基酸同源.结论 阳性噬菌体表达的短肽是EBA-175所识别的模拟表位,IRR几位氨基酸可能对EBA-175与GPA的结合起重要作用.     

抗大肠杆菌LPS多克隆抗体的制备与LPS模拟肽的筛选

目的获得抗大肠杆菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS表位的线性噬菌体展示肽克隆。方法制备兔抗鼠大肠杆菌抗血清,鉴定抗血清效价。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机线性十二肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与大肠杆菌LPS反应。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行三轮筛选,随机挑选17个克隆,其中6个克隆显示与多抗结合。大肠杆菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为250ng/ml。结论获得能与大肠杆菌LPS反应兔多克隆抗体,筛选得到可模拟大肠杆菌LPS表位的噬菌体展示线性十二肽。     

噬菌体随机肽库筛选抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗2A5的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLOH)抗体2A5的识别表位。方法以抗pfLDH的单抗2A5筛选噬菌体随机12肽库,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与单抗2A5之间的结合特性。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出21株可与2A5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列SQK(R)L,该序列与pfLDH的一级序列具有一定同源性。竞争抑制实验显示,带有核心序列的噬菌体克隆可与pfLDH竞争结合单抗2A5。结论 SQK(R)L是pfLDH单抗2A5特异识别的表位。     

抗IgE中和抗体表位的筛选和鉴定

目的: 对噬菌体线性7肽库进行筛选,得到诱发机体产生抗IgE中和抗体的IgE表位肽. 方法: 以抗IgE抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA鉴定阳性克隆. 结果: ELISA鉴定随机挑选的经3轮筛选后所得48个噬菌体克隆,其中15个克隆显示与抗IgE抗体有较强的结合能力,序列测定得到氨基酸序列为:DHIDMGL;DHMWLGL;DHQDAGF;DHMDQNL. 竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IgE竞争性结合抗IgE mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽能与抗IgE抗体特异性结合. 结论:经筛选得到的7肽序列具有相似的骨架区,并与IgE的CH3区高度同源. 初步验证这些噬菌体展示肽能与抗IgE中和抗体特异性结合,为IgE相关多肽疫苗的研究提供了依据.     

从噬菌体随机肽库中筛选SARS病毒N蛋白表位模拟肽的研究

目的获得具有生物学活性的SARSN蛋白的模拟肽。方法以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机十二肽库,并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆。结果经噬菌体富集后,从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位,即由ELISA鉴定出单克隆抗体C00835个阳性克隆,确定氨基酸序列GXLXTPXXXXGT为SARSN蛋白的一个表位;单克隆抗体C03941个阳性克隆,确定氨基酸序列TTLPXXXXAXXX为SARS病毒N蛋白的另一个表位。结论用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARSN蛋白的2个不同模拟表位,为用SARS表位去探索其病毒的结构及疫苗的研制创造了条件。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

脱氧核酶对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1增殖和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)基因特异性的脱氧核梅(DNAzyme)对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1的增殖和凋亡的影响。方法:设计合成针对EBV-LMP1基因的DNAzyme(DZ1),在P3HR-1细胞上观察其对细胞增殖活性、细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:脱氧核酶DZ1作用于P3HR-1细胞后,可显著抑制EBV-LMP1基因的表达,并呈剂量依赖性。将脱氧核酶DZ1抑制LMP1的表达,进而下调抗凋亡蛋白Bc1-2的表达,诱导细胞色素c释放,从而诱导细胞凋亡。结论:在P3HR-1细胞中,靶向LMP1可能成为潜在的基因治疗的分子靶,靶向LMP1的脱氧核酶可能成为EB病毒相关肿瘤基因治疗实验研究的新的工具。