p300/CBP相关因子对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响及机制研究

目的探讨p300/CBP相关因子(PCAF)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的作用及机制。方法组织块贴壁法获取大鼠原代VSMC,使用Ad-PCAF RNAi腺病毒转染VSMC以下调PCAF表达。选择1μg/ml的脂多糖作为VSMC迁移诱导剂。将实验分为4组:不添加脂多糖(对照组)、1μg/ml脂多糖刺激(A组)、Ad-绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒转染+1μg/ml脂多糖刺激(B组)、Ad-PCAF RNAi腺病毒转染+1μg/ml脂多糖刺激(C组)。采用Transwell实验检测细胞迁移水平。免疫荧光染色实验检测VSMC中NF-κB p65的核转位情况。Western blot检测PCAF、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平。结果 Western blot结果显示,与对照组比较,A组和B组PCAF和磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组PCAF和磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示,与对照组比较,A组和B组穿出小室细胞数明显增多,差异有统计学意义[(766.30±40.86)个/视野、(794.00±76.36)个/视野vs (202.70±22.59)个/视野,P<0.05];与B组比较,C组穿出小室细胞数明显减少,差异有统计学意义[(337.00±82.95)个/视野vs (794.00±76.36)个/视野,P<0.05]。免疫荧光染色实验结果显示,与对照组比较,A组和B组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,C组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调PCAF的表达可明显抑制VSMC迁移,其机制可能与下调PCAF后抑制NF-κB信号通路介导的炎性反应有关。     

基于p38MAPK/Nrf2/HO-1通路探讨清达颗粒对脂多糖诱导活化的小胶质细胞抗氧化作用研究

目的观察清达颗粒(QDG)对脂多糖(LPS)诱导活化的小胶质细胞抗氧化作用,探讨其与p38MAPK/Nrf2/HO-1抗氧化信号通路的可能联系。方法体外培育BV-2小胶质细胞,采用MTT法筛选合适的药物浓度,之后采用LPS(1μg/mL)诱导炎症模型,将其分为对照组、LPS组、LPS+QDG组,并LPS+QDG组设置31.25μg/mL、62.50μg/mL、125.00μg/mL 3个质量浓度亚组,检测各组细胞活性氧(ROS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的表达情况,Western Blot法检测磷酸化p38MAPK(p-p38)、p38MAPK(p38)、转录因子Nrf2、细胞核内Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)的蛋白表达情况以及p38抑制剂干预LPS诱导的炎症细胞HO-1蛋白的表达情况。结果 LPS+QDG组ROS、TNF-α、MDA的释放抑制受到一定程度上促进GSH-Px的释放,并升高p-p38、细胞核内Nrf2以及HO-1蛋白的表达。p38抑制剂干预后下调了LPS+QDG组HO-1蛋白的表达。结论清达颗粒可有效减轻LPS诱导的BV-2小胶质细胞的氧化应激损伤,这可能与激活p38MAPK/Nrf2/HO-1信号转导通路有关。     

甘草次酸通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进脂多糖诱导的小胶质细胞M2极化

目的 探究甘草次酸(GA)通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路促进脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞M2极化。方法 将小鼠BV2小胶质细胞分为阴性对照(NC)组、LPS组(100μg/ml LPS)、GA组(100μg/ml LPS+10μmol/L GA)、GA+抑制剂组(100μg/ml LPS+10μmol/L GA+10μmol/ml p38 MAPK通路抑制剂)、抑制剂组(100μg/ml LPS+10μmol/ml p38 MAPK通路抑制剂)和GA+激活剂组(100μg/ml LPS+10μmol/L GA+300 ng/ml p38 MAPK通路激活剂)。用细胞计数试剂盒8法测定细胞活力,酶联免疫吸附测定炎性因子水平,倒置显微镜观察细胞形态,Western blot检测精氨酸酶1(Arg-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及p38 MAPK通路相关蛋白表达水平。结果 与LPS组比较,GA组和抑制剂组细胞足突增多、胞体变大、细胞间隔缩小,白细胞介素(IL)1β、IL-6、iNOS、P53蛋白、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)表达显著降...     

干扰趋化因子CC受体-2调控p38MAPK信号通路抑制人口腔黏膜上皮细胞系增殖的机制

目的探讨干扰趋化因子CC受体(CCR)2基因的表达对口腔黏膜上皮细胞增殖的影响及机制。方法 Western印迹检测CCR2在口腔黏膜下纤维性变(OSF)中的表达;用CCR2的siRNA转染人口腔黏膜上皮细胞系(HOMC)细胞,转染48 h后用Western印迹检测各组细胞中CCR2蛋白表达;细胞增殖与活性检测(CCK8)实验检测细胞增殖;Western印迹检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化(p)-p38MAPK蛋白表达。结果 CCR2在OSF组织中的表达显著高于正常口腔黏膜组织(P<0.01);阴性对照(NC)-siRNA组CCR2蛋白表达、细胞存活率及p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);CCR2-siRNA组CCR2蛋白表达、细胞存活率及p-p38MAPK蛋白表达均显著低于对照组(P<0.01)。结论 CCR2在OSF中高表达,抑制CCR2的表达可通过调控p38MAPK信号通路抑制HOMC的增殖。     

miR-145抑制VSMC增殖的作用及其相关信号通路研究

目的探讨miR-145对PDGF-BB诱导的大鼠原代血管平滑肌细胞(VSMC)的作用及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导途径的作用。方法体外培养大鼠原代VSMC,再将细胞分为空白对照组、miR-NC组、PDGF-BB+miR-145组及PDGF-BB组。CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;实时RT-PCR方法检测PCNA、c-Jun及SM22a的表达水平;Western印迹方法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达、JNK和p-JNK的表达以及p38MAPK和p-p38MAPK的表达。结果 miR-145过表达后能够抑制PDGF诱导的大鼠原代VSMC增殖,并下调VSMC增殖相关基因PCNA、c-Jun的表达、上调分化相关基因SM22a的表达;PDGF-BB诱导VSMC后,ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化水平均明显上调,而转染miR-145慢病毒后再加PDGF刺激,ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化水平均明显下调。结论 miR-145能够抑制去分化型VSMC中的MAPK信号通路,进而抑制VSMC的增殖。     

转染血管紧张素Ⅱ受体(AT1)反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:评价转染AT1反义核菩酸(AT1A)对血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张Ⅱ(AngⅡ)受体亚型mRNA表达、蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶p38(P38MAPK)蛋白表达,及蛋白核酸合成的作用.方法:RT-PCR克隆AT1 cDNA序列(476bp),将克隆的AT1cDNA反向插入PcDNA3.1,构建一完整的含AT1A的质粒(PAT1A),测序鉴定.转染培养的大鼠VSMCs,RT-PCR检测转染VSMCs AT1mRNA表达.AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,比较转染与非转染的VSMCs AT1与AT2 mRNA表达(RT-PCR)、P38MAPK和PKC蛋白表达(免疫印迹,western blot)、蛋白核酸合成(3H-Leucine及3H-Thymidine掺入).结果:成功构建PAT1A.RT-PCR显示转染VSMCs AT1 mRNA表达量显著减少,与对照VSMC相比差异显著(P＜0.01).AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,与非转染VSMCs相比,转染VSMCs AT1 mRNA明显减少(P＜0.01),AT2 mRNA明显增加(P＜0.01);但两组间PKC和P38MAPK蛋白表达;3H-Leu及3H-TdR掺入量均无显著性差异(P＞0.05).结论:经AT1A封闭后,能显著抑制VSMC AT1mRNA表达,同时上调AT2 mRNA.单纯封闭AT1 mRNA并不能有效阻断AngⅡ介导的VSMCs蛋白核酸合成及VSMCs生长相关的信号转导,其他信号通路可能有代偿作用.     

内皮素-1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的可能机制

目的:探讨内皮素-1(ET-1)是否可诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化(TEMT)及可能的分子机制.方法:体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)并进行分组;倒置显微镜观察细胞的形态变化;Western印迹法检测细胞E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及磷酸化-p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞E-cadherin及α-SMA mRNA的表达. 结果:ET-1可诱导细胞由鹅卵石样变为梭形,下调E-cadherin表达,上调α-SMA、p38 MAPK及p-p38MAPK表达,增强p38MAPK活性(P＜0.05),而内皮素A受体拮抗剂BQ123能明显抑制这些变化(P＜0.05).p38MAPK特异性抑制剂SB203580可抑制ET-1诱导的细胞梭形性变,ET-1诱导的E-cadherin、α-SMA及p-p38MAPK表达改变及p38MAPK活性改变(P＜0.05),但对p38MAPK表达无明显影响(P＞0.05). 结论:ET-1可能通过激活肾小管上皮细胞p38 MAPK通路,下调E-cadherin的表达,同时上调d-SMA的表达,从而诱导肾小管上皮细胞转分化.     

慢病毒介导p38MAPK基因沉默对高糖诱导成骨细胞凋亡的影响

目的 观察p38丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)在高糖诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的作用,并探讨其对凋亡相关信号分子caspase-3、bax及bcl-2表达的影响.方法 构建靶向p38MAPK的shRNA慢病毒载体,将体外培养的MC3T3-E1成骨细胞分为正常对照组(A组)、高糖组(B组)、p38MAPK-shRNA慢病毒转染组(C组)、信号转导阻断剂组(D组)和无关shRNA转染组(E组).RT-PCR检测细胞p38MAPK mRNA的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测p38MAPK、p-p38 MAPK、caspase-3、bax、bcl-2蛋白水平,透射电镜观察细胞超微结构.结果 构建靶向p38MAPK的shRNA慢病毒载体,并成功导入MC3T3-E1成骨细胞.与高糖组和无关转染组相比,p38MAPK-shRNA转染能显著抑制高糖诱导的MC3T3-E1细胞p38MAPK过度活化,明显减少细胞的凋亡(P＜0.01);同时,p38MAPK-shRNA转染及p38MAPK阻断剂明显降低MC3T3-E1细胞中p38MAPK、p-p38MAPK、caspase-3及促凋亡基因bax蛋白表达,上调凋亡抑制基因bcl-2,与高糖组和无关转染组相比,差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05).结论 慢病毒介导p38MAPK靶向RNA干扰可通过抑制p38MAPK 信号通路的活化,降低p-p38MAPK、caspase-3、bax表达,上调bcl-2表达,最终抑制高糖所诱导的MC3T3-E1成骨细胞的凋亡.

Abstract：

Objective To examine the role of p38MAPK in high glucose-induced apoptosis of osteoblast MC3T3-E1 cell line, and to investigate its effect on the expressions of apoptosis-related molecules including caspase3, bax, and bcl-2. Methods The lentiviral vector containing short hairpin RNA targeting p38MAPK was constructed. The cultured osteoblast MC3T3-E1 cell were divided into 5 groups:normal control group(A group), high glucose group(B group), p38MAPK-shRNA transfection group(C group), signal transduction inhibitor group(D group), and transfection with negative control siRNA group(E group). RT-PCR was used to determine the p38MAPK mRNA expression levels in MC3T3-E1 cells. Flow cytometry(FCM)was employed to detect the cell apoptotic percentage. The protein levels of apoptosis-related molecules p38MAPK, p-p38MAPK, caspase-3, bax, and bcl-2 were assayed by Western blot. Ultrastructural alternation of MC3T3-E1 cell was observed under transmission electron microscopy(TEM). Results The lentiviral vector containing short hairp in RNA targeting p38MAPK was successfully constructed and transfected into MC3T3-E1 cells. RT-PCR result suggested that the siRNA targeting p38MAPK could effectively reduce the p38MAPK mRNA expression level induced by high glucose in MC3T3-E1 cell line. FCM showed siRNA significantly decreased high glucose-induced apoptosis percentage of MC3T3-E1 cells(P＜0.01). Meanwhile, we also found the siRNA significantly attenuated the proteins levels of p38MAPK, p-p38MAPK, caspase-3, and gene bax induced by high glucose in MC3T3-E1 cells, whereas the protein level of gene bcl-2 was enhanced remarkably when compared with high glucose group and negative control siRNA group(P＜0.01, P＜0.05).Conclusion The iRNA targeting p38MAPK suppressed high glucose-induced MC3T3-E1 cell apoptosis via inhibiting the activation of p38MAPK signaling pathway, thereby reducing the expressions levels of p-p38MAPK, caspase-3 and gene bax, and up-regulating the level of gene bcl-2.     

阿魏酸钠对MCAO大鼠缺血／再灌注损伤p38MAPK信号通路的影响

目的 探讨阿魏酸钠(SF)在抗大鼠脑缺血/再灌注损伤过程中对p38MAPK信号通路的影响.方法 采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,大鼠于MCAO前1 h股静脉注射不同剂量SF100 mg/kg、50 mg/kg、20 mg/kg及p38MAPK抑制剂SB203580,观察各组脑缺血再灌注损伤后大鼠神经学评分,TUNEL法检测神经细胞的凋亡及Westernblot检测p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达.结果 假手术组无神经学改变,SF100 mg/kg、50 mg/kg及p38MAPK抑制剂SB203580组神经学评分明显低于缺血再灌注组(P<0.05),各用药组间无明显差异.SF100 mg/kg、50 mg/kg、20 mg/kg及p38MAPK抑制剂SB203580TUNEL阳性细胞率(%)均较缺血再灌注组明显下降.假手术组未见p-p38MAPK表达,缺血再灌注组p-p38MAPK显著增高,SF100 mg/kg、50 mg/kg、20 mg/kg对脑组织总p38MAPK表达影响不明显(P>0.05),主要下调p-p38MAPK表达.结论 阿魏酸钠对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用机制可能与抑制p38MAPK信号传导通路有关.     

塞来昔布对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大及MAPK/ERK通路的影响

目的研究塞来昔布对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌细胞肥大及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路的影响。方法细胞培养大鼠H9c2心肌细胞,将细胞分为5组:空白组(未加任何药物处理);AngⅡ组(加入1μmol/L的AngⅡ诱导心肌肥大);AngⅡ+塞来昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L组,各组细胞加入药物培养48 h后用于后续实验。观察细胞形态学变化,测定细胞表面积和细胞中总蛋白浓度变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹检测各组细胞中p38MAPK、ERK1/2、磷酸化(p)-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量。结果与空白组比较,AngⅡ组细胞形态增大,细胞贴壁不牢,漂浮细胞增多;与AngⅡ组比较,塞来昔布各处理组细胞形态变小,漂浮细胞减少;与空白组比较,AngⅡ组细胞表面积显著增大(P0.05),细胞中总蛋白浓度显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著增加(P0.05),细胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量显著减少(P0.05);与AngⅡ组比较,塞来昔布处理各组细胞表面积显著减少(P0.05),细胞中总蛋白浓度和细胞凋亡率显著降低(P0.05),细胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量显著增多(P0.05);AngⅡ+塞来昔布50 mg/L组和100 mg/L组细胞表面积、细胞中总蛋白浓度、细胞凋亡率显著高于空白组(P0.05),细胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量低于空白组(P0.05),AngⅡ+塞来昔布150 mg/L组细胞表面积、细胞中总蛋白浓度、细胞凋亡率及细胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论塞来昔布对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大具有抑制作用,其抑制心肌细胞肥大的作用可能与激活MAPK/ERK信号通路有关。     

移植沉默miR-214的骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化的影响

目的 研究沉默miR-214的骨髓间充质干细胞（BMSC）移植对大鼠肝纤维化的影响,并探讨相关作用机制。方法 将50只肝纤维化大鼠随机分为4组,分别设为PBS组（门静脉注射0.5 mL PBS）、BMSC组（门静脉注射0.5 mL含有2×106个BMSC的PBS）、miR-214 NC组（门静脉注射0.5 mL含有2×106个转染pcDNA3.1-NC的BMSC的PBS）和miR-214 inhibitor组（门静脉注射0.5 mL含有2×106个转染pcDNA3.1-miR-214 inhibitor的BMSC的PBS）。采用实时荧光定量PCR法检测各组BMSC中miR-214的相对表达量。采用Masson染色法观察各组肝纤维化情况。采用蛋白质印迹法检测各组肝组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸化-p38 MAPK(p-p38 MAPK)的蛋白表达水平。结果 与PBS组比较,BMSC组血清ALT、AST的表达水平,以及肝组织中TGF-β1蛋白的表达水平和p38 MAPK/p-p38 MAPK比值均较低,差异均有统计学意义（P均<0...     

p38丝裂原活化蛋白激酶介导大鼠心肌缺血再灌注损伤信号传导的研究

目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用.方法:健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组、单纯缺血组、缺血再灌注组、抑制剂组,每组6只.抑制剂组于术前30 min腹腔注射p38MAPK抑制剂SB 203580(5 mg/kg体重).采用夹闭冠状动脉30 min后再灌注2 h的方法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型.采用逆转录多聚合酶链反应(RT-PCR)检测p38MAPK信使核糖核酸(mRNA)表达,免疫组化法检测p-p38MAPK蛋白表达水平及心肌细胞凋亡率.结果:单纯缺血组与对照组比较,大鼠心肌组织中p-p38MAPK的蛋白含量增加,差异有统计学意义(P<0.01),p38MAPK mRNA的表达及细胞凋亡率也增加,但差异无统计学意义(P>0.05).缺血再灌注组与对照组比较,心肌组织中p38MAPK mRNA及p-p38MAPK蛋白水平和心肌细胞凋亡均显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05～0.01).与缺血再灌注组比较,抑制剂组大鼠心肌组织p38MAPK mRNA及p-p38MAPK蛋白水平及心肌细胞凋亡均降低,(P<0.05~0.001),差异均有统计学意义.结论:p38MAPK的激活主要发生于再灌注过程;p38MAPK的活化可使缺血再灌注心肌细胞凋亡增加;抑制p38MAPK的活化可以减少缺血再灌注心肌细胞凋亡,减轻缺血再灌注所致的大鼠心肌损伤.     

p38蛋白激酶抑制剂SB203580对重症胰腺炎大鼠急性肺损伤的保护作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)抑制剂SB203580对重症胰腺炎大鼠急性肺损伤的保护作用。方法健康雄性SD大鼠60只,随机均分为3组:假手术组、重症胰腺炎组(模型组)、p38MAPK抑制剂SB203580+重症胰腺炎组(抑制剂组),12 h后取左肺下叶测组织湿/干重比,用Western印迹法检测右肺上叶环氧合酶(COX)-2、基质金属蛋白酶(MMP)9、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和磷酸化p38(p-p38)蛋白的表达,右肺下叶行病理学观察。结果与假手术组比较,模型组肺组织湿/干重比明显增加(P<0.05),肺组织p-p38、i NOS、MMP9、COX-2蛋白表达明显增高(P<0.05),与模型组比较,抑制剂组肺组织湿/干重比明显降低(P<0.05),p-p38、i NOS、MMP9、COX-2蛋白表达量明显(P<0.05)。结论 P38抑制剂SB203580通过减轻肺组织中p-p38、MMP9、i NOS和COX-2的表达,从而减轻肺组织的损伤。     

脑血疏口服液通过p38MAPK通路抑制帕金森病大鼠黑质神经炎症反应

目的研究脑血疏口服液(NXS)通过调节p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制帕金森病(PD)大鼠的神经炎症反应,从而发挥对黑质多巴胺(DA)能神经元的保护作用。方法单侧纹状体内注射神经毒素6-羟多巴胺(OHDA)(12μg/4μl)制备大鼠PD模型。将PD大鼠随机分为模型组(10只)、NXS组[10只,NXS灌胃,2.36 g/(kg·d),共30 d],另10只正常大鼠纹状体内注射生理盐水4μl作为对照组。采用免疫组织化学染色法检测各组黑质DA能神经元[酪氨酸羟化酶(TH)阳性]、小胶质细胞(Iba1阳性)的形态变化,免疫组织化学法和Western印迹法检测中脑黑质Iba1、核因子(NF)-κB、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、p38MAPK和p-p38MAPK的变化。结果与模型组相比较,NXS组旋转圈数显著减少(P0.05)。免疫组织化学结果显示,与对照组相比,模型组黑质TH阳性细胞数目明显减少(P0.05),Iba1、iNOS、NF-κB和p38MAPK免疫反应强度均明显增加(P0.05);NXS组黑质TH阳性细胞明显增多(P0.05),Iba1、iNOS、NF-κB和p38MAPK免疫反应强度均显著降低(P0.05)。Western印迹结果显示,与对照组比较,模型组损毁侧黑质Iba1、iNOS、NF-κB、p38MAPK和p-p38MAPK表达明显升高,而NXS组上述分子表达均有明显降低(P0.05)。结论 NXS可能通过抑制PD大鼠p38MAPK信号通路和降低炎症因子的表达,从而对DA能神经元发挥保护作用。     

基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对LPS刺激下大鼠Kupffer细胞炎症损伤保护作用的机制

目的基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对脂多糖(LPS)刺激大鼠Kupffer细胞炎症损伤的保护作用。方法体外培养并鉴定SD大鼠Kupffer细胞,提取并制备疏肝健脾方药含药血清,在LPS刺激大鼠Kupffer细胞产生炎症反应基础上,对Kupffer细胞进行疏肝健脾方药含药血清、p38MAPK抑制剂药物干预,ELISA法检测Kupffer细胞上清液中白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量的表达,Western印迹检测Kupffer细胞TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达。结果疏肝健脾方药含药血清提取量约为每只2~3 ml,大鼠获得纯化并经免疫荧光法鉴定Kupffer细胞(0.5~1.0)×107个,Typan blue染色测定细胞活力均在95%以上;LPS组较空白血清组IL-6、TNF-α水平均有显著升高(P0.01);与LPS组比较,各药物干预组IL-6、TNF-α表达水平显著降低(P0.01);与空白血清组比较,LPS组的p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表达均有显著升高(P0.01);与LPS组比较,SB239063能显著下调p38MAPK的蛋白表达水平(P0.01),肝健脾组亦有下调,但无显著差异(P0.05);疏肝健脾组、SB239063组的p-p38MAPK蛋白表达水平均下调显著(P0.01);TLR4蛋白表达水平以疏肝健脾组下调具有显著性差异(P0.01),SB239063组下调无显著差异(P0.05)。结论疏肝健脾方药可能对LPS刺激大鼠Kupffer细胞炎症损伤发挥保护作用,而含药血清可能是其重要作用途径之一。     

趋化素上调丝裂原活化蛋白激酶的表达促进大鼠球囊损伤后颈动脉重塑

目的观察抑制趋化素基因对大鼠颈动脉球囊损伤后血管重塑的作用及机制。方法构建大鼠颈动脉球囊损伤模型,模型组只进行球囊损伤术,不进行局部转染;慢病毒对照组球囊损伤术后于颈总动脉局部灌注对照慢病毒30 min;慢病毒抑制组大鼠在球囊损伤术后于颈总动脉局部灌注趋化素基因缺陷慢病毒30 min。在颈动脉局部转染趋化素基因缺陷性慢病毒,转染后第3天采用Real-time PCR检测颈动脉局部组织中趋化素的表达水平。观察抑制趋化素表达后颈动脉的内膜形态变化。采用5-溴-脱氧脲苷(Brd U)法检测颈动脉组织中血管平滑肌细胞的增殖情况,蛋白质免疫印迹法检测颈动脉组织中磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK 1/2)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)的水平。结果在转染趋化素基因缺陷慢病毒后第3天,慢病毒抑制组趋化素mRNA水平显著低于模型组[(0.1633±0.02)比(1.005±0.02),P0.001],差异有统计学意义。球囊损伤导致大鼠颈动脉内膜Brd U阳性颗粒明显增加,内膜显著增生,p-p38 MAPK、p-ERK 1/2、p-JNK的蛋白水平显著上升;抑制颈动脉中趋化素表达后,大鼠颈动脉内膜Brd U阳性颗粒减少,内膜增生程度减轻,p-p38 MAPK、p-ERK 1/2、p-JNK的蛋白表达水平也随之显著下降。结论趋化素可以通过上调p38 MAPK、ERK 1/2及JNK的磷酸化水平,促进颈动脉损伤后内膜增生的发生。     

网膜素改善氧化应激对人动脉血管平滑肌细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的抑制作用

目的研究网膜素对氧化应激作用下的人主动脉平滑肌细胞胶原Ⅰ、Ⅳ表达的影响。方法将人主动脉平滑肌细胞系培养,细胞密度到达90%以上后,随机分为5组:对照组、氧化应激组、网膜素组、细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂组和丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂组。其中,对照组不增加任何处理,氧化应激组加入叔丁基氢过氧化物(t-BHP,87.1μmol/L),网膜素组(87.1μmol/L t-BHP+600μg/L网膜素)、ERK抑制剂组、p38MAPK抑制剂组为在网膜素组基础上分别加入ERK抑制剂(PD98059,60μmol/L)和p38MAPK抑制剂(SB203580,100μmol/L),应用Western blot法检测细胞中胶原Ⅰ、Ⅳ表达量。结果应用MTT法,筛选t-BHP最佳作用浓度为87.1μmol/L;与对照组相比,氧化应激组人动脉平滑肌细胞内Ⅰ、Ⅳ型胶原表达显著下降(P0.01);与氧化应激组比较,网膜素组Ⅰ、Ⅳ型胶原表达显著升高(P0.01);与网膜素组比较,ERK抑制剂组和p38MAPK抑制剂组Ⅰ、Ⅳ型胶原表达均显著下降(P0.05)。结论网膜素能改善氧化应激对人动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达抑制的作用,可能通过此机制促进动脉粥样硬化斑块的稳定,ERK/p38MAPK途径可能参与网膜素的信号传导。     

斑蝥素阻断核转录因子κB信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探讨斑蝥素对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移的影响,以及从核转录因子κB(NF-κB)信号通路角度探讨其机制。方法:组织块贴壁法获取SD大鼠原代VSMCs,以1 mg/L的脂多糖诱导VSMCs增殖和迁移。实验分4组:对照组、1 mg/L脂多糖刺激组、脂多糖刺激后加用5μmol/L斑蝥素组和脂多糖刺激后加用10μmol/L斑蝥素组。观察不同浓度斑蝥素对VSMCs增殖和迁移的影响及从NF-κB信号通路角度探讨其机制。结果:细胞毒性及增殖检测实验显示,斑蝥素浓度在10μmol/L内细胞活性不受影响,脂多糖使用浓度为1 mg/L时VSMCs增殖能力显著提高,但随着脂多糖浓度的进一步提高其增殖能力增速减慢。流式细胞仪检测结果显示,脂多糖可促进VSMCs由S期向G2期转化,而斑蝥素可明显抑制脂多糖的上述作用(P0.05)。Transwell结果显示,脂多糖可显著诱导细胞迁移(P0.01),而斑蝥素可呈浓度依赖性抑制脂多糖诱导的细胞迁移(P0.01)。蛋白免疫印迹法检测显示,脂多糖显著增加磷酸化NF-κB p65水平,同时明显抑制NF-κB抑制蛋白(IκB-α)的表达,而斑蝥素呈浓度依赖性抑制脂多糖的上述作用(P0.05)。实时荧光定量聚合酶链式反应法和酶联免疫吸附测定结果均显示,脂多糖显著增加促炎因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和单核细胞趋化蛋白-1的表达(P0.05),而斑蝥素可呈浓度依赖性抑制其表达(P0.05)。结论:斑蝥素对脂多糖诱导的VSMCs的增殖和迁移具有显著抑制作用,其机制与抑制NF-κB通路并减轻炎症反应有关。     

转染血管紧张素受体Ⅱ(AT_l)反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :评价转染 ATl 反义核菩酸 (ATl A)对血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张 (Ang )受体亚型 m RNA表达、蛋白激酶 C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶 P38(P38MAPK)蛋白表达 ,及蛋白核酸合成的作用。方法 :RT- PCR克隆 ATl c DNA序列 (476 bp) ,将克隆的 ATlc DNA反向插入 Pc DNA3.1 ,构建一完整的含 ATl A的质粒(PATl A) ,测序鉴定。转染培养的大鼠 VSMCs,RT- PCR检测转染 VSMCs AT1 m RNA表达。Ang (1 0 - 7mol/ L)剌激 2 4h后 ,比较转染与非转染的 VSMCs AT1 与 AT2 m RNA表达(RT- PCR)、P38MAPK和 PKC蛋白表达 (免疫印迹 ,westernblot)、蛋白核酸合成 (3H- L eucine及 3H- Thym idine掺入 )。结果 :成功构建 PATl A。RT- PCR显示转染 VSMCs ATlm RNA表达量显著减少 ,与对照 VSMC相比差异显著 (P<0 .0 1 )。Ang (1 0 - 7mol/ L)刺激 2 4h后 ,与非转染 VSMCs相比 ,转染 VSMCs ATl m RNA明显减少 (P<0 .0 1 ) ,AT2m RNA明显增加 (P<0 .0 1 ) ;但两组间 PKC和 P38MAPK蛋白表达 ;3H- L eu及3H- Td R掺入量均无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论 :经 ATl A封闭后 ,能显著抑制 VSMC ATl m RNA表达 ,同时上调 AT2 m RNA。单纯封闭 ATlm RNA并不能有效阻断Ang 介导的 VSMCs蛋白核酸合成及 VSMCs生长相关的信号转导 ,     

PBX3基因调控p38MAPK信号对肝癌细胞生长及5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的探讨前B细胞白血病同源盒基因(PBX)3基因对肝癌细胞活力、凋亡及5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702为对照细胞,Western印迹法检测肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H和SMMC7721细胞中PBX3的蛋白表达。以LipofectamineTM2000为载体,参照其转染说明将设计合成的PBX3的特异性siRNA(si-PBX3组)及阴性对照siRNA(NC组)转染SMMC7721细胞,仅加入脂质体的为空白对照组,Western印迹检测转染后的细胞PBX3的蛋白表达。SMMC7721细胞分为NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组,细胞处理48 h,噻唑蓝(MTT)及流式细胞术分别检测4组细胞活力和凋亡率。Western印迹检测细胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和p-p38MAPK的蛋白表达。结果 PBX3在肝癌细胞中的蛋白表达均显著高于在HL-7702细胞(P0.05)。与空白对照组相比,si-PBX3组细胞中PBX3蛋白表达显著降低(P0.05)。与NC组相比,si-PBX3组和5-FU组细胞活力及p-p38MAPK、PCNA蛋白表达水平均显著降低,而细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平均显著升高(P0.05);si-PBX3+5-FU组细胞活力及PCNA和p-p38MAPK蛋白表达均显著低于si-PBX3组和5-FU组,细胞凋亡率及Bax的蛋白表达均显著高于si-PBX3组和5-FU组(P0.05)。结论抑制PBX3基因表达可降低肝癌细胞活力,诱导细胞凋亡,增强肝癌5-FU化疗敏感性,机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。