调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

microRNA-1对心肌缺氧复氧中细胞凋亡的影响

目的明确心肌缺氧复氧(H/R)时miR-1的表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法建立乳大鼠心肌细胞H/R模型,TUNEL检测细胞凋亡、Western-Blot检测凋亡蛋白表达和实时荧光定量PCR检测miR-1表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞,Western-Blot检测各组相关凋亡蛋白的表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞后H/R处理,通过TUNEL检测心肌细胞凋亡,软件分析和计算心肌细胞凋亡率。结果心肌细胞H/R后,细胞凋亡率明显增加,同时促凋亡蛋白(Bax和Caspase-3)表达水平增加和抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。在成功构建心肌细胞缺氧复氧细胞模型后,检测到心肌细胞miR-1表达水平下降。与对照组相比,感染LV-rno-miR-1组促凋亡蛋白(Bax和Caspase-3)明显增加和抗凋亡蛋白Bcl-2降低,而感染LV-rno-miR-1 sponge凋亡蛋白的结果相反。相对于感染LV-rnomiR-1组和缺氧复氧组,感染LV-rno-miR-1病毒后缺氧4小时复氧12小时,细胞凋亡率进一步增加。结论 miR-1具有促进细胞凋亡的作用。miR-1表达下降可能是心肌细胞缺氧复氧时维持稳态的一种自我调节机制。     

脑通汤对缺氧/复氧大鼠海马神经元Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响

目的探讨脑通汤对缺氧/复氧(H/R)大鼠海马神经元Bcl-2、Bax和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响及防治海马神经元凋亡的作用机制。方法取培养9 d的海马神经元,随机分为正常细胞组、H/R模型组、正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组。除正常细胞组以外,各组均缺氧24 h再复氧2 h造模。采用免疫组化检测海马神经元Bcl-2、Bax蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表达。结果免疫组化显示:与正常细胞比较,模型组Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达明显升高、Bcl-2/Bax比值下调(P0.05)。与模型组比较,脑通汤大、中、小剂量含药血清组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显增高,Bax蛋白表达明显下降,呈剂量依赖性(P0.05);但正常血清组上述指标无显著变化(P0.05)。实时荧光定量PCR显示:Bcl-2、Bax mRNA趋势同蛋白表达一致,Caspase-3 mRNA趋势同Bax mRNA表达一致。结论脑通汤可通过上调Bcl-2蛋白及基因表达和Bcl-2/Bax比值,抑制Bax及Caspase-3的过度表达,从而抑制H/R海马神经元凋亡。     

缺氧后处理与氧自由基清除剂预处理对心肌细胞膜和线粒体Bcl-2和Bax表达的影响

目的观察缺氧后处理与氧自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)联合过氧化氢酶(CAT)预处理,对心肌细胞膜和线粒体Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,探讨两者调控心肌细胞凋亡的机制。方法建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,分对照组、缺氧/复氧组、缺氧后处理组及缺氧/复氧+SOD+CAT组。应用荧光探针测定心肌细胞线粒体活性氧水平,Hoechst染色及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Wesiern blot法检测心肌细胞膜和线粒体Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与对照组比较,缺氧/复氧组、缺氧后处理组、缺氧/复氧+SOD+CAT组细胞线粒体活性氧及细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与缺氧/复氧组比较,缺氧后处理组、缺氧/复氧+SOD+CAT组细胞线粒体活性氧及细胞凋亡率明显降低(P<0.01);缺氧后处理组及缺氧/复氧+SOD+CAT组细胞膜和线粒体Bcl-2蛋白明显上调,Bax蛋白明显下调。结论缺氧后处理及氧自由基清除剂预处理抑制线粒体活性氧爆发,减轻缺氧/复氧再灌注心肌细胞凋亡,其抗凋亡可能机制与细胞膜和线粒体Bcl-2蛋白表达上调及Bax蛋白表达下调有关。     

刺囊酸对缺氧复氧诱导心肌细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 研究刺囊酸预处理对原代培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax及聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP 89 kDa)表达的影响.方法 实验随机分为6组:对照组,缺氧复氧损伤组,缺氧预处理组及低、中、高剂量刺囊酸组(0.5 μmol/L、5μmol/L和50 μmol/L),分别予以缺氧3h后再复氧2h,检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western Blot杂交法检测心肌细胞Bcl-2、Bax及PARP(89 kDa)蛋白表达变化.结果 与对照组比较,缺氧复氧损伤组心肌细胞Bcl-2蛋白表达显著低于对照组(P＜0.01),Bax蛋白及PARP(89 kDa)表达显著高于对照组(P＜0.01),细胞存活率明显低于对照组(P＜0.05).与缺氧复氧损伤组比较,不同剂量的刺囊酸预处理能显著提高细胞存活率,降低LDH活性,呈剂量依赖性;中剂量刺囊酸显著增加Bcl-2蛋白表达(P＜0.05),抑制Bax及PARP(89 kDa)蛋白表达(P＜0.05).结论 刺囊酸预处理可通过上调Bcl-2蛋白表达,抑制PARP(89 kDa)及Bax蛋白表达,抑制细胞凋亡,对抗心肌细胞缺氧复氧损伤.     

缺氧后处理对缺氧复氧心肌线粒体活性氧及细胞凋亡的影响

目的 观察缺氧后处理对缺氧复氧心肌线粒体活性氧及细胞膜和线粒体Bcl-2和Bax蛋白表达的影响,探讨其调控心肌细胞凋亡的机制.方法 构建大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型,将细胞分为对照组、缺氧/复氧纽(缺氧3h后复氧6h)、缺氧后处理组(缺氧3h后行复氧5min、缺氧5 min,反复3次,再复氧6 h).应用荧光酶标仪测定线粒体活性氧量,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Western blot检测细胞膜和线粒体Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 缺氧/复氧组和缺氧后处理组心肌细胞线粒体活性氧量较对照组显著升高(P＜0.01).缺氧后处理组心肌细胞线粒体平均荧光强度为30.74±1.88a.u./μg,显著低于缺氧/复氧组(63.17±2.75a.u./μg,P＜0.01),仍高于对照组(14.41±2.15a.u./μg).缺氧/复氧组和缺氧后处理组心肌细胞凋亡率较对照组显著升高(45.86％±3.29％和26.99％±3.35％比5.72％±1.63％,P＜0.01),缺氧后处理组低于缺氧/复氧组(P＜0.01).细胞膜和线粒体Bcl-2蛋白在缺氧后处理组显著上调,在缺氧/复氧组显著下调;Bax蛋白在缺氧后处理组显著下调,在缺氧/复氧组显著上调.结论 缺氧后处理抑制线粒体活性氧爆发,减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,其抗凋亡机制可能与线粒体和细胞膜Bcl-2蛋白表达上调及Bax蛋白表达下调有关.     

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。方法传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型。实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组。CCK8筛选α-LA的有效作用浓度;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western印迹检测细胞促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、酶切caspase-3、自噬标志分子SQSTM-1/P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及mTOR通路的表达变化。结果缺氧/复氧显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05),Western印迹结果显示Bax、酶切caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平均显著升高(P<0.05),P62和p-mTOR的表达水平降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,给予α-LA和Baf A1均能显著降低缺氧/复氧诱导的凋亡水平(P<0.05)。结论α-LA通过抑制缺氧/复氧诱导的过度自噬进而减少过度自噬诱导的细胞凋亡。     

小鼠心脏移植缺血再灌注诱导细胞凋亡的机制

目的研究小鼠心脏移植缺血再灌注后心肌细胞凋亡及其调控机制。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,选取健康C57BL/6小鼠,供心摘取后保存在4C保护液中4h,然后移植给同系(C57BL/6)小鼠,在移植心脏复跳后的不同时相切取供心:15,30,60,90,120min。TUNEL技术检测心肌组织细胞凋亡情况,免疫组化测定心肌Bcl-2、Bax蛋白的表达,半定量RT-PCR测定Caspase-3mRNA的相对含量。结果 细胞凋亡指数随再灌注时间延长而升高,同时Bax蛋白表达上调,Caspase-3mRNA含量增高。结论 心脏移植供心缺血再灌注损伤可以诱导心肌细胞凋亡,细胞凋亡的机制与Capase-3的表达增高有关,这一过程受Bcl-2家族的调控。     

当归补血汤超滤物对大鼠心肌细胞线粒体凋亡通路的影响

目的探讨当归补血汤超滤膜提取物对大鼠心肌细胞线粒体凋亡通路的影响。方法原代培养Wistar大鼠乳鼠心肌细胞,阿霉素诱导心肌细胞凋亡。实验分正常组、阿霉素组(2.5 mg/L)、当归补血汤超滤膜提取物低、中、高剂量干预组(阿霉素造模前,预先给予含30,60,120 mg/L当归补血汤超滤膜提取物完全培养基培养2 h)。MTT法检测各组细胞存活率,荧光显微镜下各组细胞凋亡形态学观察,激光共聚焦技术测定各组心肌细胞线粒体膜电位水平,蛋白印迹法测定各组Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白表达水平。结果与正常组相比,阿霉素组心肌细胞存活数明显降低,可见细胞凋亡及线粒体膜电位降低;Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax、Caspase-3表达水平升高(P0.05);与阿霉素组比较,当归补血汤超滤膜提取物干预组的心肌细胞存活数明显升高,凋亡细胞数目减少,线粒体膜电位升高,Bax、Caspase-3表达水平下调,Bcl-2蛋白表达水平上调(P0.05)。结论线粒体凋亡通路的激活是阿霉素诱导心肌细胞凋亡的机制之一,当归补血汤超滤膜提取物可调控该通路发挥心肌细胞保护作用。     

舒芬太尼对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2、LC3Ⅱ、Beclin-1表达的影响

目的探讨舒芬太尼对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin-1表达的影响。方法选取SPF级健康雄性SD大鼠52只,随机分为对照组、模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组及舒芬太尼组,各13只。模型组、3-MA组及舒芬太尼组采用左冠状动脉结扎法建立心肌缺血再灌注模型,对照组大鼠接受假手术。冠状动脉结扎前30 min,3-MA组予以3-MA溶液20 mg/kg,尾静脉注射;舒芬太尼组予以枸橼酸舒芬太尼注射液3μg/kg,尾静脉注射;模型组、对照组分别予以等体积0.9%氯化钠溶液,尾静脉注射。比较各组血清心肌酶水平、心肌细胞凋亡指数(AI)、心肌组织Bcl-2蛋白、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平。结果与模型组比较,3-MA组、舒芬太尼组大鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,心肌组织AI,心肌组织Bax蛋白、LC3Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表达水平降低,且舒芬太尼组低于3-MA组,差异均有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,3-MA组和舒芬太尼组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值较高,且舒芬太尼组高于3-MA组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论舒芬太尼能明显减轻心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤,减少心肌细胞凋亡,其作用可能与下调LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达,抑制心肌细胞自噬有关。     

姜黄素激活自噬对非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体途径凋亡的影响

目的探讨姜黄素对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的治疗作用及机制。方法油红O染色观察各组大鼠肝内细胞脂滴分布,透射电镜观察肝组织中自噬泡形成情况。蛋白印迹检测P62、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬相关蛋白(Beclin-1)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、相关x蛋白(Bax)、线粒体内细胞色素C(mCytc)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3、Caspase-9)标记蛋白的表达水平。结果与正常对照组比较,肝组织脂质沉积在模型组中明显增加;姜黄素明显抑制模型组大鼠肝组织脂质沉积,自噬抑制剂削弱姜黄素的治疗作用;透射电镜观察发现正常对照组可见散在自噬泡,模型组自噬泡数量显著减少,姜黄素可明显增加自噬体数量。蛋白印迹结果提示,模型组大鼠肝组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9、P62蛋白表达均升高,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低;经姜黄素治疗后肝组织中Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高;自噬抑制剂可以部分抑制姜黄素对自噬和凋亡相关蛋白的影响。结论姜黄素对NAFLD大鼠模型的抗凋亡作用与诱导自噬有关。     

原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白表达的影响

目的:观察原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)和凋亡相关基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达的影响,探讨原花青素在大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡中发挥的作用及可能的调控机制。方法:40只雄性SD大鼠随机等分为4组,即正常组,模型组,原花青素低剂量组[原花青素50 mg/(kg·d)],原花青素高剂量组[原花青素100 mg/(kg·d)],灌胃给药,每天1次,连续2周。末次给药后结扎冠状动脉左前降支(LAD)30 min再灌注120 min,建立大鼠心肌缺血再灌注模型。测定肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性、心肌梗死面积;用Western blot检测各组细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达;原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡。结果:与正常组比较,模型组大鼠CK-MB活性显著增强、心肌梗死面积增大,心肌细胞凋亡指数升高,Caspase-3、Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax降低(P0.05);与模型组比较,原花青素高、低剂量组大鼠CK-MB活性显著减弱、心肌梗死面积减小,细胞凋亡指数显著降低,Caspase-3、Bax蛋白表达显著减弱,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax增加(P0.05)。结论:原花青素可拮抗缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡,其机制可能与Caspase-3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2表达升高,Bcl-2/Bax比例增加有关。     

自噬参与高糖缺氧诱导的人脐静脉内皮损伤机制的实验研究

目的 观察高糖缺氧状态人脐静脉内皮细胞（HUVECs）自噬水平的变化,探讨自噬在这一过程中所起到的作用。 方法 通过体外细胞培养的方法培养HUVECs并分为6组,即正常对照组、高糖组、正常细胞缺氧组、高糖缺氧组、高糖缺氧+雷帕霉素组、高糖缺氧+3-甲基腺嘌呤（3-MA）组。各组经过相应处理后,通过流式细胞仪、Caspase-3活性试剂盒检测凋亡率、Western blot检测自噬相关蛋白（LC-3、Beclin-1、Atg-5和STSQM1）的表达情况。 结果 与正常缺氧组相比,高糖缺氧组的自噬相关蛋白LC-3B、Beclin-1和Atg-5表达降低,STSQM1表达升高（均P<0.05）,使用雷帕霉素可以上调高糖缺氧组自噬水平并且降低细胞凋亡率,加入自噬抑制剂3-MA使高糖缺氧组自噬下调,细胞凋亡率上升（均P<0.05）。 结论 高糖缺氧状态下HUVECs自噬功能受损,上调自噬可以降低凋亡率,发挥保护细胞的作用。     

通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液对大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨受损的心肌微血管内皮细胞对大鼠心肌细胞凋亡的影响及通心络的干预作用。方法:制备3种心肌微血管内皮细胞条件培养液:正常心肌微血管内皮细胞(RCMECs)条件培养液,同型半胱氨酸(Hcy)诱导损伤的RCMECs条件培养液和通心络干预的RCMECs条件培养液。将大鼠胚胎H9c2心肌细胞分为4组:(1)正常对照组:弃去原培养基,换为无血清细胞培养基(DMEM);(2)N-CM组:弃去原培养基,换为正常RCMECs条件培养液;(3)H-CM组:弃去原培养基,换为Hcy诱导损伤的RCMECs条件培养液;(4)T-CM组:弃去原培养基,换为通心络干预的RCMECs条件培养液。JC-1试剂检测细胞线粒体膜电位(MMP);流式细胞仪检测细胞活性氧簇(ROS)水平;活细胞成像系统动态观察各组心肌细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞色素-C(Cyt-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞白血病淋巴瘤-2相关x蛋白(Bax)和B细胞白血病/淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达。结果:与正常对照组的心肌细胞比较,N-CM组心肌细胞MMP、ROS、Cyt-C蛋白表达及凋亡无明显变化(P0.05);与N-CM组比较,H-CM组心肌细胞MMP降低,ROS生成增加,凋亡增加,Cyt-C、Caspase-3和Bax蛋白表达上调(P均0.01),Bcl-2蛋白表达下调(P0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞MMP升高,ROS生成减少,凋亡减少,Cyt-C、Caspase-3和Bax蛋白表达下调(P0.05,P0.01),Bcl-2蛋白表达上调(P0.01)。结论:损伤的心肌微血管内皮细胞条件培养液可诱导心肌细胞凋亡,通心络可抑制该过程。     

siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病自噬及凋亡的影响

目的探讨siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型自噬及凋亡的影响。方法体外0.6 mmol/L油酸诱导HepG2细胞脂质沉积建立NAFLD细胞模型,将HepG2细胞分为对照组、模型组、eIF2α-siRNA干扰组、NC-siRNA干扰组。油红O观察各组细胞内脂滴分布。采用Real-time PCR检测各组细胞eIF2αmRNA表达情况。LC3质粒标记绿色荧光蛋白(GFP-LC3)转染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察细胞内绿色点状聚集的自噬小体分布,Honchst 33258染色观察细胞凋亡情况。Western blotting检测自噬、凋亡相关蛋白P62、LC3Ⅱ、Beclin-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3及p-eIF2α、eIF2α的表达。结果 Real-time PCR及Western blotting实验表明,与对照组相比,模型组eIF2α蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组eIF2α蛋白及mRNA表达明显下降。与对照组相比,模型组p-eIF2α表达增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组p-eIF2α表达明显下降。荧光显微镜观察提示,与对照组相比,模型组自噬体数量明显降低;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组自噬体数量明显增加。Hoechst 33258染色分析提示,与对照组相比,模型组凋亡率明显增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组凋亡率明显减少。Western blotting检测提示,与对照组相比,模型组细胞Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均增加,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低(P均0.05),经过eIF2α-siRNA干扰后,eIF2α-siRNA干扰Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均降低,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加。结论 siRNA靶向抑制eIF2α基因通过增强自噬及抑制细胞凋亡改善NAFLD,细胞模型脂肪变性。     

拓扑替康对食管癌EC9706细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨拓扑替康(TPT)对食管鳞癌细胞株(EC9706)自噬和凋亡的影响。方法使用20 mg/L TPT和(或)5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理人食管鳞癌细胞EC9706,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TPT对食管癌EC9706细胞生长的抑制作用,单丹磺酰尸胺(MDC)法检测TPT对EC9706细胞自噬水平的影响,采用流式细胞仪技术检测TPT对EC9706细胞凋亡的影响,Western印迹测定TPT对EC9706细胞自噬相关蛋白Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响。结果流式细胞仪检测结果显示,TPT作用于EC9706细胞48 h后,TPT组、3-MA组及TPT+3-MA组细胞凋亡结率分别为(32.45±2.79)%、(7.58±1.12)%及(48.69±3.51)%。MDC染色结果显示TPT能够诱导细胞内自噬囊泡的出现,而3-MA能显著抑制这一现象。Western印迹结果显示对照组、TPT组、3-MA组及TPT+3-MA组Beclin1和Caspase-3蛋白的相对灰度值分别为0.62±0.06、0.91±0.12、0.47±0.04、1.04±0.08和0.54±0.05、0.84±0.11、0.42±0.03、0.71±0.07。结论 TPT康可以诱导食管鳞癌细胞自噬和凋亡的发生,而3-MA能够通过抑制自噬上调Caspase-3的表达增强对食管癌细胞的杀伤作用。     

自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧过程中的表达及其意义

目的 探讨自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧(OGD)过程中的表达及其意义.方法 将PC12 细胞分为正常对照组、缺糖缺氧1、4和12 h组.MTT法检测细胞存活率,Western印迹法检测各组PC12细胞中BECN1、Bcl-2及Bax蛋白的表达水平.结果 与正常对照组相比,OGD 1及4 h组PC12细胞存活率下降(均P<0.05),BECN1蛋白表达升高,且Bcl-2/Bax比值升高;而与缺糖缺氧1和4 h组相比,OGD 12 h组细胞存活率明显下降(P<0.01),BECN1蛋白表达及Bcl-2/Bax比值亦明显降低.结论 自噬蛋白BECN1及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax参与了PC12细胞OGD损伤过程.在OGD早期,自噬起主要作用,并对OGD PC12细胞起一定的保护作用,随着OGD时间的延长,凋亡在其中占主导地位,促进凋亡蛋白表达,引起PC12细胞的死亡.     

HMGB1对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响研究

目的研究高迁移率蛋白1(HMGB1)对缺氧复氧心肌细胞氧化损伤的影响。方法构建H9C2细胞缺氧复氧损伤模型,ELISA法检测培养液上清中HMGB1水平,q RT-PCR检测细胞中HMGB1基因的转录水平。在H9C2细胞中转染HMGB1 si RNA后进行缺氧复氧处理,硫代巴比妥酸比色法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)含量,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,流式细胞术测定细胞凋亡情况,Western blot测定细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)蛋白水平。结果缺氧复氧后H9C2细胞中HMGB1转录水平升高,细胞分泌的HMGB1水平也升高,与正常培养的细胞相比,差异具有统计学意义(P0.05);细胞中转染HMGB1 si RNA后可以明显抑制HMGB1的转录和合成;敲低HMGB1可以降低缺氧复氧后的H9C2细胞中MDA水平,促进细胞中SOD合成,减少细胞释放LDH,降低细胞凋亡水平,减少Caspase-3、Caspase-9活化,促进Bax的表达,与单纯缺氧复氧的心肌细胞相比,差异具有统计学意义(P0.05)。结论缺氧复氧诱导心肌细胞合成HMGB1,敲低HMGB1可以减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡,减轻氧化损伤。     

黄芪多糖对大鼠缺氧/复氧诱导的心肌细胞自噬及凋亡抑制作用的机制探讨

目的：探究黄芪多糖（APS）通过调控高迁移率族蛋白1/Toll样受体4/核转录因子-κB(HMGB1/TLR4/NF-κB)信号通路对大鼠缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞自噬及凋亡的抑制作用。方法：建立H9C2心肌细胞H/R损伤模型并分为4组：对照组、H/R组、APS组和HMGB1抑制剂组。CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖能力;酶联免疫吸附试验检测细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6含量;透射电镜观察细胞自噬小体的形成;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）双染法检测细胞凋亡;实时定量PCR检测细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法检测细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、P62、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3,缩写为LC3)-Ⅱ蛋白表达水平。结果：与对照组相比,H/R组细胞增殖能力明显减弱,凋亡及自噬水平明显增加,细胞内可见大量自...     

SIRT1抑制剂sirtinol对前列腺癌DU145细胞凋亡的影响及可能机制

目的观察SIRT1抑制剂sirtinol对前列腺癌DU145细胞系细胞凋亡和细胞凋亡关键调控因子(Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3)表达变化的影响,探讨SIRT1在前列腺癌发生的可能机制。方法体外培养DU145细胞,实验分对照组(DMSO组)和sirtinol组(终浓度为10,25和50μmol/L),Western印迹检测DU145细胞SIRT1蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹检测DU145细胞中细胞凋亡关键调控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表达。结果与对照组相比,随着sirtinol浓度的增加,SIRT1蛋白表达水平逐渐降低,细胞凋亡比例增加,诱导细胞发生凋亡。不同浓度sirtinol作用DU145细胞后Bcl-2蛋白表达减少,且随剂量增加表达越低;Bax蛋白表达增加,Bcl-2/Bax比率降低;伴随Cytochrome C的释放和Caspase-3的激活。结论下调SIRT1表达诱导前列腺癌细胞DU145细胞凋亡,其机制可能与改变细胞凋亡关键调控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表达相关。