血管内皮生长因子反义寡脱氧核苷酸联合血管生成素-1对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜血管渗漏及新生血管生成的影响

目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡脱氧核苷酸(ASODN)联合血管生成素-1(angiogenin-1,Ang-1)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜血管渗漏及新生血管生成的影响.方法 选取健康雄性SD大鼠60只,随机分为正常对照组(A组)5只和糖尿病组55只,糖尿病组通过链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病模型成功后再饲养3个月行眼底荧光血管造影检查,确定DR大鼠模型且视网膜病变程度相仿的大鼠,随机抽取45只分为DR对照组(B组,5只)、PBS缓冲液对照组(C组,10只)、VEGF ASODN干预组(D组,10只)、Ang-1干预组(E组,10只)、联合干预组(F组,10只).C组玻璃体内注射PBS缓冲液5μL;D组玻璃体内注射浓度为100 μmol·L-1 VEGF ASODN 5 μL;E组玻璃体内注射浓度为160 mg·L-1Ang-1 5 μL;F组玻璃体内注射100 μmol·L-1 VEGF ASODN及160 mg·L-1 Ang-1各5μL;3 d后再次行上述操作.各组大鼠行眼底荧光血管造影检查,对比观察不同组别大鼠视网膜血管渗漏情况,病理组织切片光学显微镜下突破内界膜的观察视网膜新生血管芽细胞核数.结果 A、B、C、D、E和F组视网膜新生血管渗漏面积分别为0、( 20.98±1.14) mm2、(21.47±1.65) mm2、(14.60±1.55) mm2、(13.80 ±1.19) mm2、( 10.81±1.35) mm2;D、E、F组新生血管渗漏面积低于B、C组,差异有统计学意义(F=103.99,P ＜0.05);F组渗漏面积低于D、E组,差异有统计学意义(F=190.94,P＜0.05);B组与C组之间差异无统计学意义(t =0.22,P＞0.05).A、B、C、D、E和F组突破内界膜的新生血管芽细胞核数分别为(1.13±0.31)个、(80.31±5.21)个、(81.08 ±2.57)个、(37.37±3.41)个、(41.07±2.09)个、(14.41±1.23)个;D、E、F组突破内界膜的血管芽细胞核数均低于B、C组,差异有统计学意义(F=1339.41,P＜0.05);F组突破内界膜的血管芽细胞核数低于D、E组,差异有统计学意义(F =714.91,P ＜0.05);B组与C组之间差异无统计学意义(t=0.35,P＞0.05).结论 VEGFASODN联合Ang-1玻璃体内注射能明显抑DR大鼠视网膜新生血管的生成,减少视网膜血管渗漏.     

罗格列酮对高糖诱导视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的 探讨罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对高糖诱导视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)损伤的保护作用.方法 体外培养大鼠RGC细胞株RGC-5细胞,50 mol·L-1葡萄糖孵育细胞诱导损伤.应用CCK-8法测定并计算细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,全自动氨基酸分析仪测定细胞谷氨酸(glutamic acid,Glu)释放量,测定细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性.结果 高糖(50 mol·L-1)以时间依赖的方式抑制了RGC-5细胞的生长,高糖处理24 h、48 h和72 h生长抑制率分别为(22.37±3.49)％、(42.18±6.34)％和(57.33±5.39)％(均为P ＜0.05);与高糖组比较,高糖+不同浓度RSG组(0.1×10-6 mol·L-1、10-6 mol·L-1、10×10-6 mol·L-1)处理48 h以剂量依赖的方式降低了高糖诱导的RGC-5细胞生长:生长抑制率高糖组(42.18±6.34)％,高糖+不同浓度RSG组分别为(35.66±4.73)％、(27.35±4.15)％和(25.17±3.42)％(均为P＜0.05).与对照组比较,高糖处理24 h、48 h和72 h以时间依赖的方式促进了细胞凋亡(均为P＜0.05);与高糖组比较,高糖+不同浓度RSG组(0.1×10-6 mol·L-1、10-6 mol·L-1和10×10-6mol·L-1)处理48 h以剂量依赖的方式降低了高糖诱导的RGC-5细胞凋亡:高糖组凋亡率为(31.55±5.34)％,高糖+不同浓度RSG组分别为(23.75±3.72)％、(18.75±2.17)％和(17.53±3.05)％(均为P＜0.05).与对照组比较,高糖组Glu释放量显著增加:2组分别为(85.64±12.75)μg·L-1和(246.84±33.48)μg·L-1(P＜0.05).与高糖组比较,高糖+不同浓度RSG(0.1×10-6mol·L-1、10-6 mol·L-1和10×10-6mol·L-1)处理48 h组Glu的释放以剂量依赖的方式减少:高糖组Glu释放量为(246.84 ±33.48)μg·L-1,高糖+不同浓度RSG组分别为(175.34±23.69)μg·L-1、(117.25±18.76) μg·L-1和(109.34±15.54) μg·L-1(均为P＜0.05).与对照组比较,高糖组SOD活性显著降低:分别为(3.06±0.38) kU·g-1和(0.56±0.07)kU·g-1(均为P＜0.05),而MAD水平显著增加:分别为(5.67±0.76) μmol·g-1和(37.64±4.37) μmol·g-1(均为P＜0.05).与高糖组相比较,高糖+不同浓度RSG处理48 h组细胞中SOD活性以剂量依赖的方式增加(均为P＜0.05),而MAD水平显著降低(均为P＜0.05).结论 RSG抑制了高糖诱导的RGC损伤,其机制与RSG减少了RGC中Glu的释放和抑制氧化应激有关.     

糖基化终产物诱导视网膜微血管内皮细胞VEGF和ZO-1 mRNA合成的变化

目的 观察糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)作用下,大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells,rRMEC)的增生和活力的变化,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)合成和紧密链接蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)mRNA合成的变化.方法 采用免疫磁珠法分离培养rRMEC,0 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1和600 mg·L-1糖基化牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA)作用rRMEc,观察4 d内细胞增生变化,并采用台盼蓝染色法测定细胞活力.不同浓度的AGE-BSA(0 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)作用12 h,100 mg·L-1的AGE-BSA作用不同时间(0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h)后,采用RT-PCR和Elisa测定rRMEC中VEGF mRNA、ZO-1 mRNA和上清中VEGF含量.结果 rRMEC在0 mg·L-1、10 mg·L-1和100 mg·L-1 AGE-BSA环境中可以继续增生,600 mg·L-1细胞增生可能受到抑制,造成rRMEC活力降低.在浓度为10～400 mg·L-1 AGE-BSA作用12 h时,VEGF mRNA合成增强,上清液中VEGF蛋白表达升高;在100 mg·L-1 AGE-BSA作用2～24 h,VEGF mRNA合成首先升高,后降低并趋于稳定;作用后各组均高于作用前(P＜0.01),上清液中VEGF蛋白表达随时间延长逐渐增加.随AGE-BSA浓度的增加,ZO-1 mRNA逐渐降低;随AGE-BSA作用时间的延长,ZO-1 mRNA逐渐降低.结论 在一定范围内,VEGF mRNA和ZO-1 mRNA合成呈AGE-BSA剂量和时间依赖性.VEGF可能是促进rRMEC ZO-1 mRNA合成降低的重要因素之一.     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞促血管生成素-1和促血管生成素-2表达的影响

目的 探讨缺氧环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞中促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)表达变化及其可能的机制.方法 将人RPE细胞培养在厌氧箱中,以建立缺氧模型.按缺氧时间0h、1h、4h、12h和24 h分为5组,观察Ang-1、Ang-2与缺氧诱导因子-1 α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的变化;另取4h作为观察点,按处理因素分为缺氧对照组和HIF-1α抑制剂3-(5’-hydroxymethy1-2’-furyl)-1-benzyl indazole (YC-1)处理组,YC-1浓度分别为1μmol·L-1、10μmol·L-1和100 μmol·L-1,观察抑制HIF-1α后对Ang-1和Ang-2表达的影响. 应用免疫荧光染色法和Western blot分别检测Ang-1、Ang-2与HIF-lα蛋白的表达.结果 常氧条件下人RPE细胞内可见Ang-2蛋白表达,未见Ang-1及HIF-1α蛋白表达;缺氧条件下Ang-1和Ang-2分别与HIF-1α共表达于RPE细胞胞质中.HIF-1α与Ang-1在缺氧早期呈上升趋势,其中HIF-1α于缺氧后4h表达最高(0.451±0.022,与0h相比t=5.401,P＜0.05),24h后有所下降;Ang-1于缺氧后24 h表达最高(1.342±0.059,与0h相比t=20.100,P＜0.01);Ang-2表达几乎不变(1.542±0.129、1.621 ±0.131、1.574±0.146、1.624±0.027,与0h相比t=0.044、0.673、0.244、0.700,均为P＞0.05).浓度为1 μmol·L-、10 μmol·L-1和100 μmol·L-1的YC-1均可有效抑制HIF-1α蛋白的表达(t=21.583、27.154、27.431,均为P＜0.01).HIF-1α蛋白表达下调后,Ang-1蛋白表达也随之受到抑制(t=9.492、15.487、17.942,均为P＜0.05),而Ang-2蛋白表达无明显变化(f=0.859、0.178、1.565,均为P＞0.05).结论 缺氧条件下人RPE细胞表达Ang-1上调,并与HIF-1α表达具有时相关系,Ang-2无明显变化;抑制HIF-1α表达后,Ang-1表达随之降低.提示在脉络膜新生血管生成过程中Ang-1的表达可能受HIF-1α选择性调控.     

溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤细胞生长的影响

目的 研究溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞生长的影响.方法 MTT法测定不同浓度(5μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40μmol·L-1和80 μmol·L-1)和不同时间(分别作用24 h和48 h)溪黄草乙素对人Rb细胞株增殖的影响;碘化丙啶染色,流式细胞术观察溪黄草乙素对Rb细胞周期及细胞凋亡的影响.结果 溪黄草乙素各个剂量组对Rb细胞的增殖均有显著抑制作用,OD值随溪黄草乙素浓度升高而下降,抑制率随浓度增加而增加.溪黄草乙素对Rb细胞株的IC50为130 μmol·L-1,且随着溪黄草乙素剂量增加对Rb细胞株抑制作用增强.不同剂量组(对照组、5 μmol·L-1组、10 μmol·L-1组、20 μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80 μmol·L-1组)溪黄草乙素作用Rb细胞24 h后,细胞凋亡率分别为:(1.07±0.03)%、(5.13±0.82)%、(8.67±1.20)%、(14.39±2.07)%、(26.45±3.01)%、(34.18±1.25)%;作用Rb细胞48 h后,细胞凋亡率分别为:(2.36±0.27)%、(6.49±1.15)%、(11.90±1.54)%、(19.21±2.66)%、(37.10±3.62)%、(47.55±3.19)%.表明溪黄草乙素作用Rb细胞24 h和48 h后Rb细胞的凋亡率在各个剂量组均显著升高,也呈现一定的剂量-效应关系,提示溪黄草乙素对Rb细胞凋亡率的影响随着剂量增加而升高.结论 溪黄草乙素可阻滞细胞进入C2/M期,进而诱导Rb细胞株凋亡.     

角膜碱烧伤后VEGF与新生血管渗漏性的相关性实验研究

目的 研究大鼠角膜碱烧伤后新生血管渗透率的变化并探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对渗透率的影响.方法 建立大鼠角膜碱烧伤模型,于术后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10d伊文兰示踪法检测新生血管渗透率,PCR法检测角膜组织中VEGF-RNA的表达.以正常大鼠角膜作为对照.结果 正常及碱烧伤后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d大鼠角膜新生血管渗透率依次为0 mg·L-1·mm-2(1.14±0.17)mg·L-1·mm-2,(0.24±0.08)mg·L-1·mm-2,(0.29±0.16)mg·L-1·mm-2,(0.14±0.10)mg·L-1·mm-2,(0.09±0.06)mg·L-1·mm-2和(0.05±0.04)mg·L-1·mm-2;角膜组织中VEGF-RNA水平依次为(1.09±0.31)×106拷贝·μg-1总RNA,(7.01±1.99)×106拷贝·μg-1总RNA,(1.01±0.59)×106拷贝·μg-1总RNA,(2.43±0.43)×106拷贝·μg-1总RNA,(0.99±1.31)×106拷贝·μg-1总RNA,(0.95±0.03)×106拷贝·μg-1总RNA和(0.17±0.15)×106拷贝·μg-1总RNA,其中7 d和10 d的VEGF-RNA低于正常水平(P7=0.011,P10=0.006).经Pearson相关分析,新生血管渗透率和VEGF-RNA水平呈正相关改变(r=0.866,P＜0.01).结论 VEGF在新生血管渗漏的调节机制中起着重要作用;大鼠角膜碱烧伤后期,新生血管渗漏性增高难以应用VEGF机制进行解释的现象,提示可能存在其他的新生血管渗漏调节机制.[眼科新进展 2009;29(1):18-20]     

姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1血管生成拟态形态学和病理改变的影响

目的 研究不同浓度姜黄素对人脉络膜黑色素瘤细胞株(OCM-1)血管生成拟态形态学和病理学改变的影响.方法 三维培养OCM-1细胞株,观察梯度浓度为0μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1的姜黄素对OCM-1细胞株血管生成拟态形成的影响,分别进行形态学观察和病理学PAS染色.结果 形态学观察显示:姜黄素0 μmol·L-1组:OCM-1细胞有浸润,在鼠尾胶上叠加生长,随着时间的延长,部分细胞逐渐伸展、变形,呈长条状、梭状或弧状;培养l周后细胞与细胞之间相互连接,并可呈管状、腔样、树枝样、网状等管腔结构,即血管生成拟态;姜黄素10μmol·L-组:部分OCM-1细胞能够形成条梭状和长条形,血管生成拟态形成;姜黄素20 μmol·L-组:部分OCM-1细胞能呈长条形和梭形,但不能形成血管生成拟态;姜黄素30 μmol·L-组:大部分细胞呈圆形,少数细胞能形成长条形和梭形,但不能形成血管生成拟态;姜黄素40 μmol·L-1组细胞皱缩成圆形,不能形成血管生成拟态.病理学PAS染色显示:姜黄素0μmol·L-1组:大部分肿瘤细胞表达PAS阳性物质,相互连接形成环状、管腔样结构,即血管生成拟态;姜黄素10 μmol·L-1组:部分OCM-1细胞呈条梭状和长条形,PAS染色阳性,形成网格状血管生成拟态结构;姜黄素20 μmol·L-1组:部分OCM-1细胞呈长条形和梭形,PAS染色阳性,少部分呈网格状结构;姜黄素30 μmol·L-1:大部分细胞呈圆形,PAS染色阴性,少数细胞能形成长条形和梭形,PAS染色阳性,但不形成网格状结构;姜黄素40 μmol·L-1组:细胞皱缩成圆形,PAS染色阴性,不形成网格状结构.结论姜黄素在体外可以抑制OCM-1细胞株血管生成拟态的形成,存在形态学和病理学改变,呈浓度依赖性.姜黄素浓度达到30 μmol·L-1时,对OCM-1细胞株血管生成拟态的形成具有明显的抑制作用.     

白藜芦醇对过氧化氢诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对过氧化氢(H2O2)诱导人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)氧化损伤的保护作用.方法 HLEC传代培养24h后,分别加入不同浓度(5μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1) RES预处理12 h后,加入100 μmol·L-1 H2O2继续孵育24 h,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,MTT比色法检测RES对H2O2诱导的HLEC活力的影响,流式细胞仪检测HLEC细胞凋亡率,比色法检测凋亡相关因子caspses-3及caspase-9的表达.结果 氧化损伤可以诱导HLEC形态改变,RES处理后,细胞形态逐渐得到改善.MTT结果显示RES对HLEC活性无抑制作用,RES(5μmol·L-1、10 μmol· L-1、20 μmol· L-1、40 μmol·L-1)孵育24 h后细胞存活率分别为(101.30±4.49)％、(100.31±3.53)％、(101.71±3.33)％、(99.30±3.00)％,与对照组(99.67±2.67)％比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05);模型组HLEC经氧化损伤处理后,细胞存活率(34.33±3.71)％明显下降,用20 μmol·L-1及40 μmol·L-1 RES处理后,HLEC存活率分别提高到(57.33±5.61)％和(72.67±6.98)％,与模型组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).流式细胞计数结果显示:对照组HLEC凋亡率为(1.99±0.17)％,经H2O2处理后,模型组HLEC凋亡率为(51.73±4.97)％,20μmol·L-1、40 μmol·L-1 RES处理后,HLEC凋亡率分别为(34.43±3.67)％、(26.55±2.07)％,与模型组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).此外,RES还可以减少H2O2所致HLEC内caspses-3及caspase-9的表达.结论 RES可以明显抑制HLEC凋亡,其抑制凋亡的作用可能是其防止和延缓白内障发生发展的细胞学基础,从而为寻求有效的防治白内障药物提供可靠的实验依据.     

人参皂苷RG3对脉络膜新生血管的抑制作用

目的 分别从体外实验和体内实验两个方面探讨人参皂苷RG3对脉络膜新生血管的抑制作用.方法 体外实验:MTT检测人参皂苷RG3对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的抑制作用,HUVEC分为正常组(含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基)、对照组(含2 g· L-1 DMSO)和12.5 μmol·L-1、25.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1、100.0 μmol·L-1人参皂苷RG3给药组,给药处理6h后测定其吸光度值.HUVEC分为对照组(含2g·L-1DMSO)和100.0Iμmol·L-1人参皂苷RG3组,小管形成实验检测人参皂苷RG3对小管形成的抑制作用,Western blotting检测人参皂苷RG3对VEGF蛋白表达的影响.体内实验:雄性C57BI/6J小鼠20只,随机分为对照小鼠组和人参皂苷RG3小鼠组,皮下注射预处理给药2周,半导体激光造模,于光凝后第1天和第21天行荧光素眼底血管造影检查.结果 MTI结果显示,正常组、对照组、12.5 μmol·L-1、25.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1、100.0 μmol·L-1人参皂苷RG3给药组的吸光度值分别为0.43±0.17、0.43 +0.05、0.33±0.02、0.24±0.02、0.18 +0.01、0.15 +0.01,对照组与正常组相比差异无统计学意义(P＞0.05),其余各组与对照组相比差异均有统计学意义(均为P＜..05).小管形成实验结果显示,对照组与100.0 μmol·L-1人参皂苷RG3组小管形成数目分别为(72.5±5.56)个和(11.33±3.71)个,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blotting结果显示,100.0 μmol·L-1人参皂苷RG3组的VEGF蛋白相对表达量(0.14±..01)明显低于对照组(0.46±0.0l),差异有统计学意义(P＜0.01).体内实验荧光素眼底血管造影结果显示,人参皂苷RG3小鼠组的荧光渗漏面积明显低于对照小鼠组.结论 人参皂苷RG3可以抑制脉络膜新生血管的形成.     

诺帝滴眼液对大鼠角膜碱烧伤的治疗作用

目的 前期研究证实诺帝滴眼液能有效抑制大鼠角膜新生血管(corneal neovascu-larization,CNV),在此基础上进一步探讨诺帝滴眼液对大鼠角膜碱烧伤的综合疗效,并探索其有效浓度的最佳值,为将来诺帝滴眼液应用于临床奠定理论基础.方法 建立大鼠碱烧伤模型,分为空白对照组、1 g·L-1地塞米松组、0.25 g·L-1和1 g·L-1诺帝滴眼液治疗组.定量分析CNV生长、角膜混浊程度以及角膜上皮愈合情况的变化,HE染色及电镜观察炎症,性角膜的组织学形态.结果 0.25 g·L-1和1 g·L-1诺帝滴眼液治疗组CNV生长、角膜混浊程度及角膜上皮缺损均小于空白对照组(P<0.01);治疗组间比较,1 g·L-1诺帝滴眼液抑制CNV效果最佳(P<0.05);1 g·L-1诺帝治疗组与地塞米松组抑制CNV程度无明显差异(32.97%±5.76%、29.53%±7.63%,P>0.05),但1 g·L-1诺帝治疗组角膜上皮愈合优于地塞米松组(0.37±0.37)mm(P<0.05).结论 诺帝滴眼液能够有效抑制炎症性角膜新生血管的生长,减轻角膜混浊,并能促进角膜上皮愈合.其中以1 g·L-1浓度效果最佳.